Name: 在体外通过间充质干细胞和视网膜色素上皮之间的隧道纳米管进行线粒体转移 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T13:55:00.000+00:00
Duration: 6 min 50 s
Description: 了解间充质干细胞与视网膜色素上皮细胞之间通过隧道纳米管进行双向线粒体转移的机制。该体外方法有助于研究线粒体交换对细胞存活的影响，为视网膜损伤治疗提供新思路。

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感谢广州中科超精科技有限公司使用其商用超分辨率显微镜（HIS-SIM）进行成像、数据采集、超分辨率图像重建、分析和讨论。本工作部分得到国家自然科学基金（82125007，92368206）和北京市自然科学基金（Z200014）的支持。

1. 生成 MSC-mito-GFP 和 ARPE19-mito-RFP 细胞系
<ol>
	<li>细胞培养 
	注意：此处仅以间充质干细胞（MSCs）为例。
	<ol>
		<li>将人源MSCs在6孔板中使用hMSC培养基（含1%青霉素-链霉素，见材料表）进行培养，直至细胞密度达到80%–90%。根据细胞生长密度，每2–3天更换一次培养基。
		<ol>
			<li>吸除原有培养基，用磷酸盐缓冲液（DPBS）洗涤细胞一次（见材料表）。加入1 mL胰蛋白酶-EDTA-DPBS混合液（0.05%胰蛋白酶-EDTA：将0.25%胰蛋白酶-EDTA用DPBS按1:5比例稀释；见材料表），于37 °C培养箱中孵育3–4分钟（具体时间依细胞状态而定）。 
			注意：在显微镜下观察细胞消化情况，当大部分细胞变圆并脱离时，立即终止消化。</li>
			<li>轻轻敲击6孔板使贴壁细胞脱落，随后加入1 mL新鲜完全培养基以终止消化反应。</li>
			<li>用移液枪轻柔重悬所有细胞，并将全部收集的细胞转移至15 mL离心管中。</li>
			<li>在200 × g 条件下离心5分钟。</li>
			<li>吸除上清液，加入1 mL新鲜培养基重悬细胞沉淀。取10 µL细胞悬液进行细胞计数。</li>
			<li>在慢病毒转染前18–24小时，以每孔1 × 105个细胞的密度将MSC接种于6孔板中，确保转染时细胞融合度约为50%。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>慢病毒转染 
	注意：所有与慢病毒转染相关的操作均需在生物安全柜中进行。
	<ol>
		<li>次日将初始培养基更换为2 mL新鲜培养基，并加入含佐剂的慢病毒悬液25 µL（5.00E+08 TU/mL），随后于37 °C孵育。 
		注意：慢病毒包装由公司使用Mito-GFP质粒（pCT-Mito-copGFP）完成（见材料表和补充图S1）。</li>
		<li>孵育6小时后，弃去含病毒的培养基，更换为2 mL新鲜培养基。继续孵育，并每天更换一次培养基。 
		注意：转染后48小时可在MSCs中观察到明显的线粒体荧光表达，72小时时荧光信号进一步增强。</li>
		<li>转染后第2天，在培养基中添加嘌呤霉素（1 µg/mL）筛选成功转染的细胞。同时，向未进行病毒感染的间充质干细胞中加入等浓度的嘌呤霉素作为对照。 
		注意：mito-GFP病毒载体已构建入嘌呤霉素抗性基因。</li>
		<li>每日更换含嘌呤霉素（1 µg/mL）的新鲜培养基。当对照组细胞接近完全死亡时，停止添加嘌呤霉素。 
		注意：该浓度的嘌呤霉素不预先存在于培养基中，仅在向6孔板添加培养基时现加。</li>
		<li>去除嘌呤霉素后继续培养，直至细胞传代并冻存。将此类细胞命名为MSC-mito-GFP。 
		注意：ARPE19细胞来源于ATCC细胞库，使用含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的DMEM/F12培养基培养（见材料表），其消化与传代方法与MSCs相同。Mito-RFP质粒由公司基于Mito-GFP改造而来。最终，将成功转染的细胞命名为ARPE19-mito-RFP。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. MSC 与 ARPE19 细胞的直接共培养
注意：在此共培养系统中，MSC-mito-GFP 细胞将作为供体细胞，而 ARPE19-mito-RFP 细胞将作为受体细胞。为了区分供体和受体细胞，我们对受体细胞进行了示踪。
<ol>
	<li>用CellTrace Violet（参见材料表）对ARPE19-mito-RFP细胞的细胞质膜进行标记。 
	注意：染料CellTrace Violet的激发波长和发射波长分别为405 nm和450 nm。
	<ol>
		<li>在使用前立即向CellTrace Violet试剂小瓶中加入20 µL二甲基亚砜（DMSO），充分混匀，配制CellTrace Violet（参见材料表）储备液。</li>
		<li>将ARPE19-mito-RFP细胞培养至80%–90%的所需密度。</li>
		<li>将CellTrace Violet储备液用预热（37 °C）的DPBS稀释至所需工作浓度（1:1,000），即为染色工作液。 
		注意：CellTrace Violet的稀释必须使用DPBS，不能用培养基替代，否则会导致染色效果极差。</li>
		<li>吸除培养基，加入1 mL染色工作液，于37 °C孵育10分钟。 
		注意：若条件允许，可在5分钟后在荧光显微镜下观察染色情况。一旦达到理想的染色效果即可终止染色，因为某些细胞可能无法耐受在DPBS中长时间孵育。</li>
		<li>吸除染色工作液，用DPBS洗涤细胞2次，然后加入2 mL新鲜完全培养基。染色后至少孵育10分钟，以使CellTrace Violet完成乙酸水解反应。 
		注意：此步骤对于细胞恢复至最佳状态以及避免干扰后续实验至关重要。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向24孔板的每个孔中加入50 µL DPBS。随后将盖玻片（直径为15 mm）（参见材料表）放入孔中，静置1分钟。用负压吸除孔中的DPBS，确保盖玻片紧贴孔底。</li>
	<li>按照步骤1.1.1所述方法对供体MSCs和受体ARPE19细胞进行胰酶消化处理。</li>
	<li>细胞计数
	<ol>
		<li>取10 µL细胞悬液置于细胞计数板上进行计数。 
		注意：若细胞密度过高，可用培养基将细胞悬液稀释10倍后按上述方法操作。</li>
		<li>在24孔板的每孔中加入500 µL培养基，接种10,000个MSCs和10,000个ARPE19细胞。加样前充分混匀细胞悬液。以下为MSC细胞浓度为A/mL、ARPE19细胞浓度为B/mL时的计算示例： 
		注意：对于4个孔，共需40,000个MSCs和40,000个ARPE19细胞，总体积为2 mL。 
		含40,000个MSCs的MSC悬液体积（C）= 40,000/A µL 
		含40,000个ARPE19细胞的ARPE19悬液体积（D）= 40,000/B µL 
		用2 - (C + D) mL培养基补足总体积至2 mL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在显微镜下观察细胞，轻轻振荡培养板使细胞分布均匀，然后在培养箱中孵育24小时。</li>
</ol>
3. 采用 transwell 系统对 MSC 和 ARPE19 细胞进行间接共培养
<ol>
	<li>按照步骤 2.1 至 2.4.1 中所述进行细胞培养、标记、消化和计数。</li>
	<li>在 24 孔板的每个孔中，将 20,000 个 ARPE19 细胞接种于 1 mL 培养基中。 
	注意：本实验中使用的 ARPE19 细胞未标记线粒体。</li>
	<li>将插入物放入已接种细胞的孔中。</li>
	<li>在每个孔的上层细胞室中，将 10,000 个 MSC 接种于 100 µL 培养基中。</li>
	<li>重复步骤 2.5。</li>
</ol>
4. 细胞骨架染色
注意：整个实验过程中需避光。
<ol>
	<li>从24孔板中移除培养基，每孔加入500 µL 4%多聚甲醛（PFA）洗涤细胞一次，随后每孔加入500 µL新鲜的4% PFA，固定样品20分钟。 
	注意：Transwell 系统的插入物将被弃去。 
	注意：由于纳米管非常脆弱，我们直接使用4% PFA而非DPBS洗涤细胞，以最大程度保留完整的纳米管。</li>
	<li>去除固定剂，用 DPBS 洗涤样本，每次 10 分钟，共洗 3 次。</li>
	<li>加入 500 µL/孔的封闭液，封闭液成分为 0.5% Triton X-100（参见 材料表）和 4% 牛血清白蛋白（BSA）（参见 材料表）并在室温下孵育1小时。</li>
	<li>除去封闭液，用 DPBS 洗涤样本 3 次，每次 10 分钟。</li>
	<li>鬼笔环肽染色液的配制（参见 材料表) 
	注意：鬼笔环肽的激发波长和发射波长分别为650 nm和668 nm。
	<ol>
		<li>通过将瓶内物质溶解于150 µL无水DMSO中，配制400倍浓缩储备液。</li>
		<li>用DPBS将400倍储存液稀释至1倍，配制染色液。此即鬼笔环肽染色液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>每孔加入200 µL鬼笔环肽染色液，室温避光孵育1小时。</li>
	<li>回收染色液，用 DPBS 洗涤样本 3 次，每次 10 分钟。 
	注意：用DPBS洗涤细胞时，最好将培养板置于摇床上。</li>
	<li>用注射器针头取出盖玻片，使其自然风干。 
	注意：最佳状态是盖玻片上无可见液体，但又不完全干燥。</li>
	<li>滴加少量封片剂（参见 材料表) 滴加到载玻片上，然后小心地将盖玻片翻转盖上&#160;确保培养基均匀覆盖整个玻片表面。用指甲油密封边缘。 
	注意：等待几分钟，使指甲油完全干燥。</li>
	<li>立即采集共聚焦图像，或将其转移至切片盒中并在4 °C下短暂保存。 
	注意：理想的储存时间为2周。若超过此时间，成像效果可能会下降。</li>
</ol>
5. 共聚焦成像
注意：共聚焦成像应根据仪器操作手册进行，不同显微镜的操作可能有所差异。此处仅提供一些关键步骤。
<ol>
	<li>根据操作手册启动共聚焦显微镜，并打开四个激光通道（405、488、561、640）。</li>
	<li>在计算机上打开软件并进行初步的参数设置。
	<ol>
		<li>在流程管理面板中添加荧光通道 CF-405、CF-488、CF-561 和 CF-640。</li>
		<li>在相机控制面板中，将每个荧光通道的曝光时间调整为200 ms，并将增益强度设置为2。</li>
		<li>将激光/LED 合束器调整至80的数值。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>操作显微镜的外部控制面板，将物镜调整至20x放大倍数，并确保物镜处于最低位置。</li>
	<li>将载玻片以倒置方向放置在载物台上。</li>
	<li>激活 405 nm 激光，并使用粗调和细调焦螺旋进行对焦。通过目镜观察样品，直至可见蓝色荧光细胞。</li>
	<li>在计算机的软件界面中选择实时成像，切换至 CF-405 通道，并重新调节细调焦螺旋，直至计算机屏幕上显示清晰的蓝色荧光细胞图像。</li>
	<li>将物镜调整至 40x 放大倍数，并切换至 CF-640 通道，然后仔细调节对焦，直至可见清晰的细胞微丝结构。</li>
	<li>保持焦距恒定，依次切换至 CF-405、CF-488 和 CF-561 通道，并根据需要调整各通道成像的最佳曝光时间、增益强度和激光/LED 合束器参数。</li>
	<li>启用Z 轴图像堆栈功能，通过调节焦距确定 Z 轴的起始点和终止点，以利用 Z 轴捕获具有深度的图像。</li>
	<li>点击流程管理面板中的开始按钮进行拍照。</li>
	<li>对每一切片随机选择 10 个视野。 
	注意：任意两个视野之间不得重叠。</li>
	<li>启用延时成像功能，在选定目标视野后，设定总成像时长为24 h，拍照间隔为5 min。 
	注意：为实现延时成像，需将细胞接种于玻璃底培养皿中，并置于含有 5% CO2 气体的通风箱内。</li>
	<li>保存并导出所有图像。 
	注意：为增强对隧道纳米管（TNT）和线粒体转移的观察，采用了超分辨率成像技术。超分辨率成像使用商业化 HIS-SIM 系统完成，该系统称为 HIS-SIM（High Intelligent and Sensitive SIM），由某公司提供。图像采集使用 100x/1.5 NA 油浸物镜。</li>
</ol>
6. 数据分析
<ol>
	<li>对每张图像进行统计分析时，定量分析细胞总数、纳米管数量、Violet阳性ARPE19-mito-RFE细胞数量、显示绿色荧光的Violet阳性细胞数量（代表来自间充质干细胞（MSCs）的线粒体转移至ARPE19细胞的数量），以及显示红色荧光的Violet阴性细胞数量（代表来自ARPE19细胞的线粒体转移至MSCs的数量）。
	<ol>
		<li>为定量分析隧道纳米管（TNT）的形成，计算细胞间纳米管数量与细胞总数的比值。</li>
		<li>线粒体转移率的计算方法如下：显示绿色荧光的Violet阳性细胞数量与Violet阳性细胞总数的比值（代表线粒体从MSCs向ARPE19细胞的转移），或显示红色荧光的Violet阴性细胞数量与Violet阴性细胞总数的比值（代表线粒体从ARPE19细胞向MSCs的转移）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Investigating Mitochondrial Transfer in MSC and ARPE19 Co-Cultures

<ol><li>Caprara, C., Grimm, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+oxygen+to+erythropoietin%3A+Relevance+of+hypoxia+for+retinal+development%2C+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">From oxygen to erythropoietin: Relevance of hypoxia for retinal development, health and disease.</a> Prog Retin Eye Res. 31 (1), 89-119 (2012).</li>
<li>Ferrington, D. A., Fisher, C. R., Kowluru, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+defects+drive+degenerative+retinal+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial defects drive degenerative retinal diseases.</a> Trends Mol Med. 26 (1), 105-118 (2020).</li>
<li>Spees, J. L., Olson, S. D., Whitney, M. J., Prockop, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+transfer+between+cells+can+rescue+aerobic+respiration%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial transfer between cells can rescue aerobic respiration.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (5), 1283-1288 (2006).</li>
<li>Wei, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+transfer+from+bone+mesenchymal+stem+cells+protects+against+tendinopathy+both+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial transfer from bone mesenchymal stem cells protects against tendinopathy both in vitro and in vivo.</a> Stem Cell Res Ther. 14 (1), 104(2023).</li>
<li>Borcherding, N., Brestoff, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+power+and+potential+of+mitochondria+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The power and potential of mitochondria transfer.</a> Nature. 623 (7986), 283-291 (2023).</li>
<li>Liu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intercellular+mitochondrial+transfer+as+a+means+of+tissue+revitalization%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">Intercellular mitochondrial transfer as a means of tissue revitalization.</a> Signal Transduct Target Ther. 6 (1), 65(2021).</li>
<li>Rustom, A., Saffrich, R., Markovic, I., Walther, P., Gerdes, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanotubular+highways+for+intercellular+organelle+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nanotubular highways for intercellular organelle transport.</a> Science. 303 (5660), 1007-1010 (2004).</li>
<li>Cordero Cervantes, D., Zurzolo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peering+into+tunneling+nanotubes-the+path+forward%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+j%22%5BJournal%5D)">Peering into tunneling nanotubes-the path forward.</a> Embo j. 40 (8), e105789(2021).</li>
<li>Qin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functions%2C+methods%2C+and+mobility+of+mitochondrial+transfer+between+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">The functions, methods, and mobility of mitochondrial transfer between cells.</a> Front Oncol. 11, 672781(2021).</li>
<li>Jiang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+crosstalk+between+mesenchymal+stem+cells+and+various+ocular+cells+through+the+intercellular+trafficking+of+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic crosstalk between mesenchymal stem cells and various ocular cells through the intercellular trafficking of mitochondria.</a> Theranostics. 10 (16), 7260-7272 (2020).</li>
<li>Domhan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intercellular+communication+by+exchange+of+cytoplasmic+material+via+tunneling+nano-tube+like+structures+in+primary+human+renal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Intercellular communication by exchange of cytoplasmic material via tunneling nano-tube like structures in primary human renal epithelial cells.</a> PLoS One. 6 (6), e21283(2011).</li>
<li>Zhang, J., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+nanotubes%3A+Novel+communication+between+distant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+China+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Membrane nanotubes: Novel communication between distant cells.</a> Sci China Life Sci. 56 (11), 994-999 (2013).</li>
<li>Cheng, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+ipscs+derived+astrocytes+rescue+rotenone-induced+mitochondrial+dysfunction+and+dopaminergic+neurodegeneration+in+vitro+by+donating+functional+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">Human ipscs derived astrocytes rescue rotenone-induced mitochondrial dysfunction and dopaminergic neurodegeneration in vitro by donating functional mitochondria.</a> Transl Neurodegener. 9 (1), 13(2020).</li>
<li>Ahmad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miro1+regulates+intercellular+mitochondrial+transport+%26+enhances+mesenchymal+stem+cell+rescue+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Miro1 regulates intercellular mitochondrial transport & enhances mesenchymal stem cell rescue efficacy.</a> Embo J. 33 (9), 994-1010 (2014).</li>
<li>Li, C. J., Chen, P. K., Sun, L. Y., Pang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+mitochondrial+transfer+by+antioxidants+in+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oxid+Med+Cell+Longev%22%5BJournal%5D)">Enhancement of mitochondrial transfer by antioxidants in human mesenchymal stem cells.</a> Oxid Med Cell Longev. 2017, 8510805(2017).</li>
<li>Paliwal, S., Chaudhuri, R., Agrawal, A., Mohanty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+abilities+of+mesenchymal+stem+cells+through+mitochondrial+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Sci%22%5BJournal%5D)">Regenerative abilities of mesenchymal stem cells through mitochondrial transfer.</a> J Biomed Sci. 25 (1), 31(2018).</li>
<li>Lin, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+transfer+of+wharton%27s+jelly+mesenchymal+stem+cells+eliminates+mutation+burden+and+rescues+mitochondrial+bioenergetics+in+rotenone-stressed+melas+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Oxid+Med+Cell+Longev%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial transfer of wharton's jelly mesenchymal stem cells eliminates mutation burden and rescues mitochondrial bioenergetics in rotenone-stressed melas fibroblasts.</a> Oxid Med Cell Longev. 2019, 9537504(2019).</li>
<li>Hu, X., Duan, T., Wu, Z., Xiong, Y., Cao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intercellular+mitochondria+transfer%3A+A+new+perspective+for+the+treatment+of+metabolic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochim+Biophys+Sin+%28Shanghai%29%22%5BJournal%5D)">Intercellular mitochondria transfer: A new perspective for the treatment of metabolic diseases.</a> Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 53 (7), 958-960 (2021).</li>
</ol>

作者声明不存在任何利益冲突。

大量研究已证明，TNT介导的线粒体转移现象在多种组织细胞中是一种普遍存在的生理过程10,11,12,13。间充质干细胞（MSCs）向线粒体功能障碍细胞提供功能性线粒体，在治疗方面展现出巨大潜力3,14,15,16,17,18。
为了展示间充质干细胞（MSCs）与ARPE19细胞之间由隧道纳米管（TNT）介导的双向线粒体转移，我们构建了MSC-mito-GFP和ARPE19-mito-RFP细胞系。随后，将这两种细胞共培养24小时，并在共培养结束时进行细胞骨架染色。通过共聚焦成像，我们观察并统计了隧道纳米管的形成情况及线粒体转移率。这些观察结果可能受到共培养细胞比例和细胞密度等因素的影响。在共培养过程中，必须充分混匀两种细胞类型，并保持其处于单细胞状态，以尽量减少同型细胞形成细胞集落，从而降低两种细胞间发生线粒体转移的可能性。
流式细胞术分析也可用于检测线粒体转移率，该方法比成像后统计更为简便。然而，使用此方法计算得到的线粒体转移率会略低于实际值，因为少量的线粒体转移可能未被记录。在本方案中，需非常仔细地对成像结果进行计数，以避免遗漏或错误计数荧光伪信号。
通过构建两种具有线粒体荧光的细胞系来研究线粒体的双向转移，是本实验方案的创新之处。该方法避免了荧光染料的干扰，使实验结果更加可信。线粒体从视网膜细胞向间充质干细胞（MSCs）的转移值得进一步研究，例如，可探索在应激条件下双向线粒体转移比例的变化。
通过遵循本方案中所述的实验步骤，我们得以确定间充质干细胞可通过隧道纳米管将线粒体转移至视网膜色素上皮细胞。这一现象可能是间充质干细胞对视网膜组织产生有益作用的合理机制，从而有助于阐明间充质干细胞驱动的眼组织再生治疗的原理。

线粒体是大多数细胞类型的主要能量来源，线粒体功能障碍尤其会影响视网膜等高能量需求的组织1。视网膜中的代谢改变可引发生物能量危机，最终导致感光细胞和/或视网膜色素上皮（RPE）细胞死亡2。基于间充质干细胞（MSC）的疗法在治疗眼部退行性疾病方面已显示出疗效，而MSC对视网膜组织产生有益作用的精确机制之一可能归因于功能性线粒体的转移3,4,5,6。2004年，Rustom 等人首次报道了通过一种由隧道纳米管（TNTs）介导的新型细胞间相互作用实现线粒体转移的现象7。
在二维培养中，隧道纳米管（TNTs）表现为细长的膜突起（直径20–700 nm），长度从数十至数百纳米不等，悬浮于基质之上，可直接在两个或多个同型或异型细胞之间建立连接。这些结构富含F-肌动蛋白，能够介导细胞间物质（如线粒体）的运输。此外，TNTs两端具有开口，使相互连接的细胞之间胞质内容物得以连续流通8。
检测TNT介导的线粒体转移具有挑战性 体内 由于细胞排列密集以及线粒体追踪困难。 体外 利用细胞共培养和线粒体示踪技术进行实验，可实现对隧道纳米管形成及线粒体转移的观察8,9我们还通过共培养间充质干细胞（MSCs）和视网膜色素上皮细胞，观察到隧道纳米管（TNT）介导的线粒体转移现象。 体外10.
许多先前的研究仅观察到线粒体从间充质干细胞（MSCs）向其他细胞的单向转移3,4,5,6此前，我们也尝试使用分别标记了Mito-Tracker Green和Mito-Tracker Red的两种细胞来分析线粒体的双向转移，但染料之间的串扰干扰了实验结果。为了更精确地研究线粒体双向转移，本文采用慢病毒转染技术构建了两种具有不同线粒体荧光标记的细胞系，并通过直接共培养观察和分析了隧道纳米管（TNT）的形成及线粒体双向转移现象 体外.
简而言之，本文详细描述了一种逐步可操作的实验方案，用于示踪线粒体、将间充质干细胞（MSCs）与ARPE19细胞共培养，并分析隧道纳米管（TNT）的形成及线粒体转移过程。本实验结果证实了通过隧道纳米管介导的双向线粒体转移，不仅证明线粒体运输是一种常见的生理现象，同时也揭示了间充质干细胞对视网膜细胞潜在的治疗能力。

<table><tbody><tr><td>0.25% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>4% 多聚甲醛</td><td>Solarbio</td><td>P1110</td><td></td></tr><tr><td>6 孔板</td><td>NEST</td><td>703001</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 离心管</td><td>BD Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>24 孔板</td><td>NEST</td><td>702001</td><td></td></tr><tr><td>ARPE19 细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-2302</td><td>细胞系</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白 (BSA)</td><td>Beyotime</td><td>ST025</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace 紫色荧光染料</td><td>Invitrogen</td><td>C34557</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>NEST</td><td>801007</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>C141905005BT</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12-GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>10565-042</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清 (FBS)</td><td>VivaCell</td><td>C04002-500</td><td></td></tr><tr><td>FluorSave 封片剂</td><td>Millipore</td><td>345789</td><td></td></tr><tr><td>MSCs</td><td>Nuwacell</td><td>RC02003</td><td>细胞系</td></tr><tr><td>ncMission</td><td>Shownin</td><td>RP02010</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液 (Pen Strep)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>pCT-Mito-GFP</td><td>SBI</td><td>CYTO102-PA-1</td><td>质粒；来源&amp;nbsp; https://www.systembio.com/mitochondria-cyto-tracer-pct-mito-gfp-cmv</td></tr><tr><td>嘌呤霉素</td><td>MCE</td><td>HY-B1743A</td><td></td></tr><tr><td>移液器</td><td>Axygen</td><td>TF-1000-R-S</td><td></td></tr><tr><td>鬼笔环肽</td><td>Invitrogen</td><td>A22287</td><td></td></tr><tr><td>吐温 X-100</td><td>Solarbio</td><td>T8200</td><td></td></tr><tr><td>Transwell 小室板</td><td>Corning</td><td>3470</td><td></td></tr></tbody></table>

间充质干细胞与视网膜色素上皮细胞间通过隧道纳米管进行线粒体转移的体外研究

Mitochondrial Transfer Via Tunneling Nanotubes Between Mesenchymal Stem Cells and Retinal Pigment Epithelium In Vitro

线粒体转移是一种在多种细胞间广泛发生的正常生理现象。迄今为止的研究表明，线粒体运输最重要的途径是通过隧道纳米管（TNTs）。已有大量研究报道，间充质干细胞（MSCs）可通过隧道纳米管将线粒体转移至其他细胞。然而，关于线粒体双向转移现象的研究仍较为少见。本文所述实验方案旨在研究间充质干细胞与视网膜色素上皮细胞之间的线粒体转移现象

关键词：线粒体转移，隧道纳米管，间充质干细胞，视网膜色素上皮细胞 体外 通过两种线粒体示踪方法。
我们将转染了mito-GFP的MSCs与转染了mito-RFP的ARPE19细胞（一种视网膜色素上皮细胞系）共培养24小时。随后，所有细胞均用鬼笔环肽染色，并通过共聚焦显微镜成像。我们在ARPE19细胞中观察到具有绿色荧光的线粒体，而在MSCs中观察到具有红色荧光的线粒体，表明MSCs与ARPE19细胞之间存在双向线粒体转移。该现象提示，线粒体运输是一种正常的生理现象，在MSCs与ARPE19细胞之间亦可发生，且MSCs向ARPE19细胞的线粒体转移频率远高于 反之亦然我们的结果表明，间充质干细胞（MSCs）可将线粒体转移至视网膜色素上皮细胞，同样可以预测，MSCs未来可能通过向视网膜色素上皮细胞转运线粒体来发挥其治疗潜力。此外，ARPE19细胞向MSCs的线粒体转移仍有待进一步研究。

示意图展示了间充质干细胞（MSC）与ARPE19细胞直接共培养的实验设计 图1将表达mito-GFP的间充质干细胞（MSCs）作为供体细胞，与细胞质膜呈紫色标记的ARPE19-mito-RFP细胞作为受体细胞以1:1比例共培养。共培养24小时后，对细胞进行鬼笔环肽（phalloidin）染色，并通过共聚焦显微镜观察。所得细胞群体包括：MSC-mito-GFP细胞、ARPE19-mito-RFP细胞、含有mito-GFP的ARPE19-mito-RFP细胞，以及含有mito-RFP的MSC-mito-GFP细胞。值得注意的是，ARPE19细胞中出现mito-GFP信号，同时MSCs中出现mito-RFP信号，提示存在线粒体的双向转移。
TNT形成的特定细节如图2所示。这些结构可在同类型细胞之间（图2A-C）以及不同类型细胞之间（图2D）建立细胞间连接。隧道样纳米管（TNTs）作为连接相邻细胞的通道，具有富含F-肌动蛋白的膜结构，其末端开放，可实现细胞质连续性及线粒体的转运。通过Z轴成像可见，TNT并未牢固锚定于细胞外基质，而是悬浮于培养基中，从而区别于传统的细胞突起。线粒体转移现象如图3所示，其中violet阳性ARPE19细胞中出现弥散的绿色点状荧光，提示线粒体来源于MSCs（图3A）。violet阴性的MSCs中出现红色点状荧光，则代表线粒体从ARPE19细胞转移而来（图3B）。图4展示了在超分辨率成像下TNT的形成及线粒体转移过程，可更清晰地观察到通过TNT进行线粒体转移的细节。视频1展示了线粒体通过TNT进行转运的动态过程。
为了进一步证明线粒体转移的前提是细胞间的直接接触（例如隧道纳米管，TNT），而非线粒体的分泌与摄取，我们采用了一种先前报道的共培养方法10。如图5A所示，将MSCs和ARPE19细胞分别接种于Transwell小室的上室和下室中。二者之间由带有0.4 µm孔径的滤膜隔开，该滤膜可阻断MSCs与ARPE19细胞之间的直接接触，但允许线粒体通过。共培养24小时后，检测下室中的ARPE19细胞，几乎未观察到来自上室MSCs的mito-GFP信号（图5B）。这些结果表明，线粒体转移需要MSCs与ARPE19细胞之间的直接接触。
最终对TNT的形成和线粒体转移进行了定量分析，相应结果如图6所示。间充质干细胞（MSCs）向视网膜色素上皮细胞转移线粒体的能力显著强于ARPE19细胞（p = 0.0286）。这些结果表明，间充质干细胞具有将线粒体转移至视网膜色素上皮细胞的能力。
<img alt="线粒体转移过程示意图，MSC-mito-GFP，ARPE19-mito-RFP 共培养，细胞相互作用。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66917/66917fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
图1：间充质干细胞（MSCs）与ARPE19细胞共培养的示意图。 表达mito-GFP的间充质干细胞与用CellTrace Violet标记的ARPE19-mito-RFP细胞以1:1的比例共培养24小时。在CellTrace Violet阳性（violet+）细胞中观察到的mito-GFP信号表示线粒体从MSCs转移至ARPE19细胞，而在CellTrace Violet阴性（violet-）细胞中观察到的mito-RFP信号表示线粒体从ARPE19细胞转移至MSCs。缩写：GFP = 绿色荧光蛋白；RFP = 红色荧光蛋白；MSCs = 间充质干细胞。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66917/66917fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="用 mito-GFP 和 mito-RFP 标记的细胞线粒体的共聚焦显微镜三维切片图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66917/66917fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：MSCs 与 ARPE19 细胞之间的隧道纳米管（TNT）形成。 白色箭头指示隧道纳米管（TNT）的形成，绿色箭头指示携带 mito-GFP 的线粒体，红色箭头指示携带 mito-RFP 的线粒体。(A,B) ARPE19 细胞之间的隧道纳米管（TNT）形成。(C) MSCs 细胞之间的隧道纳米管（TNT）形成。(D) MSCs 与 ARPE19 细胞之间的隧道纳米管（TNT）形成。Z 轴成像显示悬浮于培养基中的隧道纳米管（TNT）。比例尺 = 25 µm。缩写：MSCs = 间充质干细胞；TNTs = 隧道纳米管。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66917/66917fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞结构中Mito-GFP、Mito-RFP、紫染、鬼笔环肽的荧光显微镜图像，图A-B。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66917/66917fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 3"> 
图3：间充质干细胞向ARPE19细胞的线粒体转移。（A）白色虚线圈表示线粒体（mito-GFP）从间充质干细胞（MSCs）向ARPE19细胞的转移；（B）黄色虚线圈表示线粒体（mito-RFP）从ARPE19细胞向间充质干细胞的转移。比例尺 = 20 µm。缩写：GFP = 绿色荧光蛋白；RFP = 红色荧光蛋白；MSCs = 间充质干细胞。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66917/66917fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示细胞结构和荧光标记的MSC-GFP与ARPE19-RFP共聚焦显微镜图像" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66917/66917fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图4"> 
图4：通过超分辨率显微镜观察间充质干细胞（MSCs）与ARPE19细胞之间的隧道纳米管形成及线粒体转移。（A和B）线粒体从间充质干细胞向ARPE19细胞的转运。（C）超分辨率成像下隧道纳米管的细节。（D）在超分辨率成像下，来源于间充质干细胞的绿色线粒体存在于ARPE19细胞内。比例尺 = 5 µm。缩写：MSCs = mesenchymal stem cells；TNTs = tunneling nanotubes。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66917/66917fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="MSC-mito-GFP 细胞共培养示意图，用于细胞相互作用研究的荧光显微镜观察，Phalloidin 染色。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66917/66917fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 5"> 
图 5：在 Transwell 系统中 MSCs 与 ARPE19 细胞间接共培养时，线粒体转移几乎无法检测到。 （A）MSCs 与 ARPE19 细胞在 Transwell 系统中进行共培养的示意图。（B）MSCs 与 ARPE19 细胞间接共培养 24 小时后，Transwell 板底部 ARPE19 细胞的代表性图像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66917/66917fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="TNT 形成和线粒体转移柱状图；细胞间通讯；定量数据分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66917/66917fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 6"> 
图 6：TNT 形成与线粒体转移的定量分析。（A）TNT 形成，（B）线粒体转移。缩写：M = MSCs = 间充质干细胞；A = ARPE19 细胞；TNTs = 穿梭纳米管；M-A = MSCs 与 ARPE19 细胞之间的 TNT 形成；M-M = MSCs 之间的 TNT 形成；A-A = ARPE19 细胞之间的 TNT 形成。n = 4，均值 ± 标准差，Mann-Whitney U 检验，*p &lt; 0.05。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66917/66917fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
补充图 S1：质粒 pCT-Mito-copGFP 的图谱。 Mito-GFP (CYTO102-PA-1) 为外购获得。线粒体Cyto-Tracer质粒pCT-Mito-GFP (CMV) 通过Cox8标签与copGFP融合，从而实现线粒体的copGFP标记。该copGFP融合蛋白由CMV启动子驱动，可在HeLa、HEK293和HT1080等细胞系中实现高效表达。Mito-RFP由mito-GFP改造而来，将其中的GFP替换为RFP，并携带嘌呤霉素抗性基因。该质粒的慢病毒包装由专业公司完成。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66917/66917_Supplementary%20figure.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
视频 1：间充质干细胞与 ARPE19 细胞之间通过隧道纳米管（TNT）介导的线粒体运输。 隧道纳米管由间充质干细胞与 ARPE19 细胞之间的双向移动形成，促进线粒体从间充质干细胞向 ARPE19 细胞转移。缩写：MSCs = 间充质干细胞；TNTs = 隧道纳米管。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66917/66917_TNT_Video.zip" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>

本文介绍了一种实验方案，包括线粒体示踪、间充质干细胞（MSCs）与视网膜色素上皮细胞（ARPE19）的直接共培养操作，以及观察和统计分析隧道纳米管（TNT）形成和线粒体转移的方法，用于表征MSCs与ARPE19细胞之间通过隧道纳米管进行的线粒体交换。

线粒体转移是一种在多种细胞间广泛发生的正常生理现象。迄今为止的研究中，最重要的……

本研究聚焦于间充质干细胞（MSC）与视网膜色素上皮细胞之间的双向线粒体转移。我们正在探究细胞间线粒体的转移过程，并确定两个不同方向上线粒体转移的比例。由于组织结构致密以及对线粒体进行体内追踪存在技术困难，目前在体内检测由隧道纳米管（TNT）介导的线粒体转移仍具有挑战性。用不同颜色标记两个不同细胞的线粒体也十分困难。我们之前的研究通过在体外共同捕获间充质干细胞（MSC）与视网膜细胞（包括角膜内皮细胞、光感受器细胞和视网膜色素信号细胞），观察到了隧道纳米管（TNT）介导的线粒体转移现象。来自间充质干细胞的功能性线粒体转移能够挽救受损的视网膜细胞。

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科研

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生物学

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关键词：人胚胎干细胞，视网膜色素上皮细胞，地理萎缩，视网膜下移植，大眼模型

了解间充质干细胞与视网膜色素上皮细胞之间通过隧道纳米管进行双向线粒体转移的机制。该体外方法有助于研究线粒体交换对细胞存活的影响，为视网膜损伤治疗提供新思路。

间充质干细胞与视网膜色素上皮细胞间通过隧道纳米管进行线粒体转移的体外研究

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