Name: 通过 Yeast Surface Display 进行蛋白质工程 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-29T13:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 49 s
Description: 学习酵母表面展示技术进行蛋白质工程，通过流式细胞术筛选与特定抗原结合的蛋白变体。该方法可精确控制选择条件，为开发下一代细胞疗法和蛋白质开关提供高效平台。

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本工作由奥地利科学基金（FWF项目W1224——蛋白质生物分子技术博士项目——BioToP，以及FWF项目ESP 465-B）、奥地利联邦数字与经济事务部、奥地利国家研究、技术和发展基金会（资助克里斯蒂安·多普勒研究协会，即“下一代CAR T细胞”克里斯蒂安·多普勒实验室）以及私人捐赠给圣安娜儿童癌症研究所（奥地利维也纳）的资金支持。E.S. 是奥地利科学院在圣安娜儿童癌症研究所设立的DOC奖学金获得者。插图使用BioRender.com制作。

Optimizing Protein Functions Through Yeast Surface Display Techniques

M.W.T. 获得 Miltenyi Biotec 的资金资助。所有作者均为利用酵母表面展示技术开发的技术和工程蛋白相关专利申请的发明人。

酵母表面展示技术已发展成为蛋白质工程中的关键方法之一。尽管该技术通常用于亲和力1,18,40,41、表达/稳定性24,27,42,43以及活性28,44的改造，但也可用于表位作图45,46或对酵母细胞表面单个突变体进行表征9等其他用途。在本实验方案中，我们提供了启动酵母表面展示筛选实验的基本步骤，包括使用磁珠和流式细胞分选进行筛选，以及通过错误倾向PCR（epPCR）对酵母文库进行多样化以实现亲和力成熟。
进行传统酵母表面展示筛选的一个基本要求是必须具备足够质量的可溶性蛋白。使用正确折叠、高纯度且具有明确寡聚状态（即单体蛋白应仅以单体形式存在）的目标蛋白作为起始材料，最有可能成功筛选出对目标抗原具有高亲和力的蛋白变体。对于难以表达的目标蛋白，可采用基于细胞的筛选方法，这是一种克服上述限制的合理策略47。然而，酵母表面展示具有诸多优势，例如可直接在酵母细胞表面表征所获得的蛋白变体，而无需进行耗时费力的克隆、可溶性表达及蛋白纯化步骤。变体的亲和力和稳定性均可直接在酵母表面进行分析9。
在本方案中，我们展示了如何使用G4蛋白变体文库，更具体地说，是10th 人纤维连接蛋白的III型结构域被选用于在小分子A1120存在下与抗原hRBP4结合。通过磁珠筛选与流式细胞分选相结合的方式，获得了在多轮筛选中对目标抗原结合能力逐步增强的变异体富集结果。图2B）。我们证明，使用较低浓度的抗原能够筛选出高亲和力的蛋白质变体（图2C）。通常，通过酵母展示筛选可获得的亲和力可达纳摩尔甚至皮摩尔范围。18最终亲和力取决于靶抗原、筛选轮次数量、亲和力成熟过程、所用结合支架以及应用的分选策略。本方案未涵盖对单个蛋白质变体的表征，相关内容已在我们先前的研究中详细说明。9尽管酵母展示技术最初被用于抗体片段（如scFv）的改造1,40该方法也已广泛用于非抗体类蛋白质10. 
总之，酵母表面展示是一种强大的蛋白质工程工具，能够产生具有新颖或改良特性的蛋白质变体，例如可结合几乎任何靶蛋白和/或具有更高稳定性。

酵母表面展示是蛋白质工程领域中的关键技术之一。该技术能够筛选出具有理想特性的蛋白质变体，例如亲和力或稳定性得到改善的变体。该技术于1997年首次被提出1，是除噬菌体展示2,3、核糖体展示4和哺乳动物细胞展示5,6,7之外最常用的展示技术之一。目的蛋白（POI）通过与锚定蛋白融合而展示在酵母细胞表面。存在多种不同的锚定蛋白，其中最常见的是将POI融合至酵母交配蛋白Aga2p的C末端1,8。此外，POI通常两侧带有两个标签，例如血凝素标签（HA标签）和c-myc标签，这使得可通过荧光标记的抗体和流式细胞术检测展示水平（图1A）。典型的酵母筛选流程包括磁珠筛选与流式细胞分选的结合使用。磁珠筛选能够处理大量细胞，并富集那些即使亲和力较低但仍能与靶抗原结合的蛋白质变体，因为抗原负载的磁珠与细胞表面展示蛋白之间的多价相互作用会产生亲和力效应，从而避免低亲和力变体的丢失（图1B）。流式细胞分析与分选的优势在于可以直观地观察展示的POI变体与标记抗原的结合情况。因此，可对结合阳性细胞群进行分选和培养，经过多轮分选后逐步富集具有理想特性的蛋白质变体。此外，还可进行额外的随机突变循环，以进一步增加多样性，从而提高发现有助于提升蛋白质亲和力和/或稳定性的新突变的概率。
酵母表面展示具有若干优势，例如：（a）真核表达系统能够实现蛋白质的氧化折叠以及真核生物特有的翻译后修饰（如N-糖基化）；（b）由于可检测蛋白两侧的两个肽段标签，实现表达水平的归一化；（c）可通过流式细胞术直观监测筛选进程（如结合细胞的比例和结合强度）；（d）可在酵母上直接分析单个蛋白质突变体（如分析其热稳定性及亲和力），从而为繁琐的蛋白质表达与纯化提供一种节省时间的替代方案9。事实上，这两种亲和力（KD 值）以及稳定性（T50 酵母表面展示蛋白的亲和力值与使用生物物理方法及可溶性蛋白获得的数据表现出良好的相关性9,10,11,12酵母表面展示技术已被用于多种蛋白质的改造，例如抗体片段13,14,15,16，10th III型纤连蛋白结构域17,18, rcSso7d19,20或 knottins21同样，研究人员已通过改变随机化位置以及氨基酸密码子的使用来优化酵母文库的设计17,22,23酵母表面展示技术已被证实可成功用于稳定性工程14,15,24,25，亲和力18,26,27酶活性28,29,30,31和蛋白质表达32此外，利用酵母表面展示技术，还实现了更复杂的应用，例如在小分子存在或不存在条件下的条件性结合20.
在本方案中，我们以G4文库（基于10）为例，详细描述了利用酵母表面展示技术进行筛选实验的全部关键步骤th III型纤连蛋白结构域（Fn3），在小分子A1120存在下针对人视黄醇结合蛋白4（hRBP4）抗原筛选获得20该筛选旨在获得一种依赖于小分子的蛋白质-蛋白质相互作用，该小分子可作为分子开关使用。值得注意的是，尽管酵母表面展示技术存在其他替代方法，但典型的酵母筛选通常以靶向抗原的结合为目标，且不预先具备结合亲和力。本文涵盖了酵母筛选实验的全部步骤，包括酵母文库的培养、磁珠筛选、流式细胞分选以及通过易错PCR（epPCR）进行的亲和力成熟。因此，本方案是对以往酵母表面展示方案的补充。33,34 并可作为酵母表面展示筛选的基础图1）与任意选定的酵母文库和目标抗原结合使用。
<img alt="酵母展示示意图及用于蛋白文库筛选与富集的亲和力成熟流程图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66994/66994fig1v5.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：酵母表面展示原理及酵母表面展示筛选的典型工作流程。（A）将目的蛋白（POI）克隆至酵母表面展示载体中，通常在其N端和C端分别带有HA标签和c-myc标签。该构建体与酵母交配蛋白Aga2p融合，以实现在细胞表面的展示。图中所示蛋白为来自PDB ID: 6QBA20的工程化结合蛋白“RS3”。（B）流程图展示了酵母表面展示筛选的典型工作流程，该流程结合了通过磁珠筛选和流式细胞分选富集具有理想特性的蛋白变体，以及利用epPCR进行亲和力成熟的过程。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66994/66994fig1largev5.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>10-beta 电转感受态 &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;&amp;nbsp;</td><td>NEB</td><td>C3020K</td><td></td></tr><tr><td>琼脂-琼脂，神户 I</td><td>卡尔·罗特</td><td>5210.5</td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素钠盐</td><td>卡尔·罗斯</td><td>K029.2</td><td></td></tr><tr><td>抗c-myc抗体，克隆9E10，AF488</td><td>Invitrogen</td><td>MA1-980-A488（Thermo Fisher）</td><td></td></tr><tr><td>抗c-myc抗体，克隆9E10，AF647</td><td>Invitrogen</td><td>MA1-980-A647（Thermo Fisher）</td><td></td></tr><tr><td>抗HA抗体，克隆16B12，AF488</td><td>BioLegend</td><td>901509 (Biozym)</td><td></td></tr><tr><td>抗HA抗体，克隆16B12，AF647</td><td>BioLegend</td><td>682404 (Biozym)</td><td></td></tr><tr><td>BamHI-HF</td><td>NEB</td><td>R3136S</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白，冷乙醇组分</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸一水合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1909</td><td></td></tr><tr><td>D-半乳糖</td><td>卡尔·罗特</td><td>4987.2</td><td></td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Difco 酵母氮源基础培养基</td><td>Becton Dickinson（BD）&amp;nbsp;</td><td>291940</td><td></td></tr><tr><td>七水合磷酸氢二钠</td><td>卡尔·罗特</td><td>X987.3</td><td></td></tr><tr><td>DL-二硫苏糖醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>D-山梨醇</td><td>卡尔·罗斯</td><td>6213.1</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;磷酸盐缓冲液（10倍浓缩）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>14190169</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads 生物素结合磁珠</td><td>Invitrogen</td><td>11047（Fisher Scientific）</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 磁力架</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>EBY100</td><td>ATCC</td><td>MYA-4941</td><td></td></tr><tr><td>1 mm 电穿孔比色皿（用于 &lt;em&gt;E.coli&lt;/em&gt;)</td><td>VWR</td><td>732-1135</td><td></td></tr><tr><td>电穿孔比色皿 2 mm（用于酵母）</td><td>VWR</td><td>732-1136</td><td></td></tr><tr><td>乙醇，绝对</td><td>MERCK</td><td>1070172511</td><td></td></tr><tr><td>GeneMorph II 随机突变试剂盒</td><td>安捷伦科技</td><td>200550</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Bacto 胰蛋白胨氨基酸</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>223120</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>AppliChem</td><td>131339.1211</td><td></td></tr><tr><td>LE 琼脂糖&amp;nbsp;</td><td>Biozym</td><td>840004</td><td></td></tr><tr><td>乙酸锂二水合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4158</td><td></td></tr><tr><td>Monarch DNA 胶回收试剂盒</td><td>NEB</td><td>T1020S</td><td></td></tr><tr><td>Monarch PCR &amp;amp; DNA 纯化试剂盒</td><td>NEB</td><td>T1030S</td><td></td></tr><tr><td>Multifuge 1S-R</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NheI-HF</td><td>NEB</td><td>R3131S</td><td></td></tr><tr><td>生长培养基</td><td>NEB</td><td>B9035S</td><td></td></tr><tr><td>pCTCON2</td><td>Addgene</td><td>#41843</td><td></td></tr><tr><td>青霉素G钠盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3032</td><td></td></tr><tr><td>Penta-His 抗体，AF488</td><td>Qiagen</td><td>35310</td><td></td></tr><tr><td>Penta-His 抗体，AF647</td><td>Qiagen</td><td>35370</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨（酪蛋白经胰酶消化）</td><td>卡尔·罗斯</td><td>8986.3</td><td></td></tr><tr><td>Q5 高保真 DNA 聚合酶&amp;nbsp;</td><td>NEB</td><td>M0491S</td><td></td></tr><tr><td>SaII-HF</td><td>NEB</td><td>R3138S</td><td></td></tr><tr><td>乙酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8750-1KG</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>卡尔·罗斯</td><td>3957.2</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钠一水合物</td><td>卡尔·罗斯</td><td>K300.2</td><td></td></tr><tr><td>Steritop 螺口瓶顶滤器</td><td>MERCK</td><td>S2GPT01RE</td><td></td></tr><tr><td>链霉亲和素，AF488</td><td>Invitrogen</td><td>S32354 (Thermo Fisher)</td><td></td></tr><tr><td>链霉亲和素，AF647</td><td>Invitrogen</td><td>S32357（Thermo Fisher）</td><td></td></tr><tr><td>硫酸链霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6501</td><td></td></tr><tr><td>三水合柠檬酸钠</td><td>卡尔·罗斯</td><td>4088.1</td><td></td></tr><tr><td>紫外-可见分光光度计</td><td>安捷伦</td><td>8453</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物，微颗粒状</td><td>卡尔·罗特</td><td>2904.4</td><td></td></tr><tr><td>Zymoprep 酵母质粒小提 II</td><td>Zymo Research</td><td>D2004&amp;nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

利用酵母表面展示技术进行蛋白质工程

Protein Engineering by Yeast Surface Display

蛋白质工程能够改进特定蛋白质的现有功能，或产生新的功能。在蛋白质工程领域中，最广泛使用且用途多样的工具之一是酵母表面展示技术，该技术可将一组随机化的蛋白质表达于酵母细胞表面。表型（例如酵母表面展示蛋白与目标抗原的结合）与基因型（编码该蛋白质变体的质粒）之间的关联，使得能够针对所需特性对该文库进行筛选，并对富集的变体进行后续测序。通过结合磁珠筛选与流式细胞分选技术，可选择并富集对目标抗原结合能力增强的蛋白质变体。值得注意的是，除了亲和力成熟之外，即使初始无结合亲和力，也可通过该方法实现对目标抗原的结合。本文提供了一个逐步操作的实验方案，涵盖酵母表面展示筛选实验的所有关键步骤，并给出了典型的酵母表面展示结果示例。我们证明，酵母表面展示是一种适用广泛且稳健的方法，任何具备流式细胞仪的分子生物学实验室均可建立该技术。

针对与小分子药物A1120结合的抗原hRBP4，筛选了G4文库。文库的流式细胞分选染色操作如方法6所述，所采用的设门策略如图2A所示。初始设门根据细胞形态学包含所有细胞，第二道门（FSC-宽度直方图）采用严格设门策略，用于筛选单细胞并去除细胞聚集体。第三道也是最终的设门显示了蛋白变体表达水平（x轴）与抗原结合能力（y轴）的关系。对同时显示表达信号和结合信号的酵母细胞进行分选。重要的是，分选设门设置得较为严格，以富集具有高结合信号、即高亲和力的结合结构域。这种严格筛选在整个筛选过程中实现了对特异性结合靶抗原的酵母展示细胞的有效富集（图2B）。在后续的流式细胞分选轮次中，抗原浓度降低了10倍（从100 nM降至10 nM）。因此，总体结合信号减弱，仅有高亲和力的结合子仍可被检测并分选（图2C）。
<img alt="流式细胞术分选门控图；显示FSC、SSC及抗原结合水平。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66994/66994fig2v5.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：Fn3为基础的G4文库通过酵母表面展示技术筛选结合抗原（在A1120存在下的人RBP4）的代表性结果。（A）酵母文库分选的通用门控策略。第一个门控（FSC vs. SSC）用于选择所有酵母细胞并排除碎片信号；第二个门控（FSC-W直方图）旨在去除细胞聚集体，仅保留单个酵母细胞。第三个门控显示表面展示水平（HA标签或c-myc标签的检测）与抗原结合（此处为在5 µM A1120存在下的hRBP4，通过抗His抗体检测）之间的关系。文库还仅用二抗染色（无抗原），此条件下不应出现抗原结合信号。被分选的细胞以蓝色高亮显示。（B）G4文库在三轮流式细胞分选过程中的演化情况。每一轮筛选后，结合性细胞群体的富集程度均可观察到。（C）使用较低浓度的抗原可实现对靶向目标抗原亲和力更高的蛋白变体的筛选。当抗原浓度（此处为hRBP4）降低10倍时，出现不同的对角线分布，表明存在具有较高（被分选细胞，蓝色）或较低亲和力的克隆。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66994/66994fig2largev5.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本方案描述了进行酵母表面展示筛选实验的关键步骤，以富集能够结合目标抗原的蛋白质变体。

蛋白质工程能够改进特定蛋白质的现有功能，或产生新的功能。其中应用最广泛的方法之一是……

在我的实验室中，我们通过将蛋白质工程与细胞工程相结合，来设计下一代细胞疗法。我们对蛋白质组分进行改造，以获得新功能或优化现有功能，然后将这些改造后的蛋白质整合到细胞治疗剂中。我们进一步开发了表面展示技术，用于特定应用，包括蛋白质稳定性工程、小分子调控的蛋白质开关工程，以及针对癌症相关活化受体构象的特异性靶向。相较于噬菌体展示或核糖体展示等其他展示技术，酵母表面展示的优势在于能够在分选过程中通过流式细胞术对文库进行可视化观察，并可精确控制筛选条件，例如抗原浓度和分选门控的严格程度。首先，通过将10微升生物素结合磁珠重悬于990微升PBSA中，来准备第一次磁珠筛选所需的磁珠。洗涤时，将离心管置于磁力架上，打开管盖，静置两分钟。然后小心移除上清液。将洗涤后的磁珠重悬于1.5毫升微量离心管中，加入1毫升含6.7至33皮摩尔生物素化抗原的PBSA溶液。孵育后，将试管置于磁力架上静置2分钟（管盖打开），移除上清液，并用1毫升PBSA洗涤负载抗原的磁珠。待磁珠沉降后，移除 PBSA。然后将负载抗原的磁珠重悬于 50 微升 PBSA 中。准备细胞、抗原磁珠以及用于阴性筛选的磁珠溶液。洗涤后，将抗原偶联微球重悬于 50 微升 PBSA 中，并将裸微球重悬于 150 微升 PBSA 中。进行第一次阴性筛选时，将 50 微升洗涤后的裸微球加入 950 微升洗涤后的细胞悬液（PBSA 中），在 4 摄氏度下孵育 1.5 小时。孵育结束后，将含有裸微球-细胞悬液的离心管置于磁力架上，并打开管盖。将盖子中的任何液体用移液器吸入离心管中，静置两分钟。然后将未结合的细胞转移至新的微量离心管中，并加入50 µL洗涤过的磁珠。经过三轮阴性筛选后，向细胞中加入50 µL抗原负载的磁珠溶液。在 4°C 下孵育两小时。现在将含有抗原负载珠的细胞置于磁力架上，并打开管盖。用移液器将管盖内的任何液体转移至离心管中。等待两分钟后，弃去未结合的细胞。其余所有步骤均按照第一种抗原磁珠筛选方法所述进行操作。经过三次阴性筛选和一次阳性筛选后，将细胞迅速重悬于1毫升SDCAA培养基中，并转移至含有较大量SDCAA培养基的摇瓶中。在酵母文库中于SGCAA培养基中过夜诱导蛋白质表面表达后，收集足够量的细胞沉淀，沉淀量应覆盖文库多样性的10倍，弃去上清液。将沉淀重悬于PBSA中，并转移至微量离心管。每管使用三千万个细胞进行染色。根据实验多样性准备相应数量的离心管，包括一个不含抗原的对照管。随后在室温下以2000 × g离心5分钟。将沉淀重悬于200 µL含有抗原的PBSA中，并在4 °C孵育1小时。再次离心后，从沉淀中去除 PBSA。接着将细胞重悬于 100 微升含有用于表面染色和抗原检测的抗体的冷 PBSA 中。在 4 摄氏度下孵育 30 分钟。孵育后，在4摄氏度下以2000 × g离心5分钟。向沉淀中加入1毫升PBSA，并重复离心步骤。然后移除大部分上清液，仅留下20至30微升，以防止沉淀干燥。分选前立即用预冷的PBSA重悬沉淀。随后直接将细胞分选至SDCAA培养基中。分选后，将细胞转移至含有较大量SDCAA培养基的摇瓶中，在30摄氏度、180 RPM振荡条件下孵育。

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