Name: 一种用于识别美国手语和英语中潜在PLK1抑制剂的双语计算流程 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-04-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 34 s
Description: 了解用于识别PLK1潜在抑制剂的双语计算流程。该方法结合分子对接、PRODIGY结合亲和力计算和ADMET-S评估，帮助研究人员筛选具有理想成药性和生物利用度的候选化合物。

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本研究获得了美国国立普通医学科学研究所、美国国立卫生研究院（1R15GM148942-01）、国家医学图书馆（R25LM014208）以及匹兹堡大学动量奖（Momentum Grant）的资助。本研究工作使用了特拉华大学的 DARWIN 平台（darwin.hpc.udel.edu），计算资源由先进网络基础设施协调生态系统：服务项目分配编号 [MED230016] 提供 &amp;#38; 支持（ACCESS）项目，由美国国家科学基金会资助，项目编号为 #2138259、#2138286、#2138307、#2137603 和 #2138296。

所有所用软件工具的研究资源标识符（RRIDs）和版本号均在材料表中提供。
1. 目标蛋白的制备
<ol>
	<li>为本项目创建一个工作目录，用于存储结构文件和计算结果。</li>
	<li>访问蛋白质数据库（Protein Data Bank），获取目标蛋白PLK1-PBD的编号（4HCO11），并使用哈佛分子力学化学平台的图形用户界面（CHARMM-GUI17,18）解决可能存在的结构差异问题。
	<ol>
		<li>访问CHARMM-GUI网站并注册学术账户。注册完成后，点击输入生成器（input generator），选择PDB Reader，输入PDB编号4HCO，然后点击下一步。</li>
		<li>在下一页中，确保仅选中PROA——蛋白链A，并在接下来的两页中均点击下一步。</li>
		<li>将step1_pdbreader.pdb下载至指定目录，将文件重命名为4hco或自定义名称，并使用文本编辑器或代码将文件中所有组氨酸残基（HSD）的名称更改为（HIS）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对PLK2-PBD（PDB编号：4XB019）重复上述操作。 
	&#8203;注意：对于无PDB编号的结构（如PLK3-PBD），应使用同源建模结构或Alphafold20预测结构，并通过Uniprot21确保序列准确性。</li>
</ol>
2. 天然产物数据库筛选
<ol>
	<li>访问天然产物 SuperNatural 3.0 数据库，选择疾病子页面22。
	<ol>
		<li>选择乳腺癌，置信区间可为任意值或无限制，因为所有结果都需要通过程序进行过滤，然后点击 查找。点击 下载完整结果 文件，将结果以 .csv 格式保存至指定目录。随后，使用代码筛选出置信区间为 0.900–1.000 的条目（共 1,193 个，总数为 73,406）。 
		&#8203;注：也可在通路子页面23中输入乳腺癌的京都基因与基因组百科全书（KEGG）标识符进行查询。</li>
		<li>前往 常见问题 子页面，在页面底部可找到可供下载的完整数据集（.csv 文件）。下载该文件后，使用脚本将数据集中的简化分子线性输入规范（SMILES）字符串与上述 1,193 个分子的 SuperNatural 标识符进行匹配，并生成其 SMILES 字符串列表（smiles.csv）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 整群抽样
<ol>
	<li>下载包含几乎所有开源软件包的 Anaconda 发行版（<a href="https://www.anaconda.com/download" target="_blank">https://www.anaconda.com/download</a>），或单独下载集成开发环境（IDE），例如 RStudio（RStudio Desktop - Posit）或 Jupyter（Jupyter Notebook）。使用 Conda 安装开源的化学信息学与机器学习软件包 RDKit24。 
	注意：有关安装 Conda 及创建 Conda 环境的说明，请参阅 conda 25.9.2.dev31 文档。有关在环境中安装 RDKit 及配置模块的信息，请参阅《RDKit 2025.03.6 安装文档》。</li>
	<li>将 补充文件 1 中的“Lipinski.py”脚本与“smiles.csv”文件置于同一文件夹中并运行该脚本。该脚本将激活 Conda 环境，加载模块，读取 SMILES 字符串文件，根据利平斯基五规则（Rule of 5）对生物利用度和吸收性进行筛选（从 1,193 个化合物中筛选出 n = 999），并将筛选后的 SMILES 字符串列表保存为“all.csv”。 
	注意：请确认已成功生成“all.csv”文件，并包含约 999 个化合物（即筛选后的子集）。打开文件以验证每个条目是否均为有效的 SMILES 字符串。在 RStudio 控制台中执行以下命令后，可运行 Python：library(reticulate); reticulate::use_condaenv(nameofcondaenv)。</li>
	<li>将 补充文件 1 中的“Clustering.py”脚本与“all.csv”文件置于同一文件夹中，并在首选的 IDE 中运行。该脚本将加载聚类模块，读取 SMILES 字符串文件，并基于分子指纹和 Tanimoto 相似性将化合物分为 50 个聚类。 
	&#8203;注意：50 个代表性结构（rep_struct.csv，位于 补充文件 1 中）将以 SMILES 字符串列表的形式保存在目录中。Tanimoto 相似性（在化学信息学中也称为 Jaccard 指数）25 是一种基于分子指纹量化两个分子之间结构相似性的指标，Tanimoto 系数范围为 0（无相似性）至 1（指纹完全相同）。请确保“rep_struct.csv”文件中恰好包含 50 个唯一的 SMILES 条目，每个条目代表一个聚类。</li>
</ol>
4. 蛋白质-配体对接与结合亲和力计算
<ol>
	<li>访问基于 AutoDock Vina 的腔穴检测引导盲对接网络服务器（CB-Dock2）26。
	<ol>
		<li>进入对接选项卡并上传 4HCO 蛋白。</li>
		<li>为上传配体，点击绘制配体，然后从 SMILES 字符串列表中粘贴一个配体（rep_struct.csv，补充文件 1）。在下一个字段中输入电子邮件地址以便更方便地收集压缩数据，然后点击自动盲对接。对剩余的 49 个小分子聚类代表物重复此操作，并将其标记为 lig1、lig2、…、lig50。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>前往收到的电子邮件结果，将压缩文件夹下载到名为 4HCO 的子目录中，并按顺序命名（4hco_lig1、4hco_lig2、…、4hco_lig50）。
	<ol>
		<li>解压文件夹，并删除除以“.complex.pdb”结尾的蛋白-配体复合物文件外的所有文件。 
		&#8203;注意：请确认每个配体目录（4hco_lig1 至 4hco_lig50）均包含相应的“.complex.pdb”文件。</li>
		<li>使用文本编辑器打开一个示例 .complex.pdb 文件，仔细记录蛋白链 ID：P 和配体 ID：A:UNL，然后使用文件压缩工具重新压缩文件夹。</li>
		<li>访问用于评估选择性和蛋白-配体结合亲和力的 PROtein binDing enerGY 预测（PRODIGY）网络服务器27。&#160;
		<ol>
			<li>点击PRODIGY-lig（蛋白-小分子）选项卡，以一次上传包含多个蛋白-配体复合物的压缩文件夹（例如 4hco_lig1）。输入蛋白链和配体 ID，完成验证码验证，然后点击提交 Prodigy-Ligand。</li>
			<li>数据处理完成后，点击所有输出的归档文件 (.zip) 下载结果。对所有子目录（直至 4hco_lig50）重复前述步骤及结果收集。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>对蛋白 4XB0 和 PLK3 重复所有步骤，需特别注意文件命名规范（如 4xb0_lig1 或 plk2_lig1）。 
		&#8203;注意：确认所有蛋白-配体复合物的输出 CSV 文件均已下载，并包含 ΔG 和界面残基数据两列。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. ADMET-S 评估
<ol>
	<li>访问 ADMETlab3 3.0 平台28.
	<ol>
		<li>点击 开始使用 在……下方 &#34;ADMET 筛选&#34; 并输入一组SMILES。
		<ol>
			<li>打开 rep_struct.csv 将SMILES字符串列表的全部内容复制到文本字段中并提交。</li>
			<li>使用平台的彩色编码评分系统评估药代动力学和类药性质，并将评估结果下载为 .csv 文件以供进一步分析。</li>
			<li>进入 SwissADME 工具29.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将全部50个分子的SMILES字符串列表粘贴到输入框中。
	<ol>
		<li>点击 运行 用于计算生物利用度和渗透性等性质，包括血脑屏障穿透能力。</li>
		<li>将输出结果下载为 .csv 文件，以便与其他 ADMET 结果进行整合。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>下载并安装 ToxTree30 （通过决策树方法进行毒性危害评估）与用户操作系统兼容。
	<ol>
		<li>打开软件 通过 使用命令：sh Toxtree.sh 运行终端</li>
		<li>将SMILES字符串单独输入Tox游戏副本，依据Cramer规则对毒性进行分类。</li>
		<li>将结果导出为 .csv 文件，以便与其他 ADMET 数据整合。 
		&#8203;注意：检查 ADMETLab3 和 SwissADME 输出的 CSV 文件中配体数量是否一致（n = 50），并确认 Toxtree 的结果已根据 Cramer 分类规则（I–III）对每个化合物进行了分类。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>安装 ORCA 后31，创建一个名为 stability 的文件夹，并在工作目录中为每个分子创建子文件夹（例如 plk1_lig1、plk1_lig2、...、plk1_lig50）。
	<ol>
		<li>使用 Avogadro（Avogadro）从每个分子的 SMILES 字符串构建分子结构：进入 Extensions 选项卡，点击 Optimize Geometry 以优化分子几何构型。生成 ORCA 输入文件 通过 扩展应用 &#62; ORCA &#62; 生成 ORCA 输入并应用以下设置： 
		! B3LYP OPT FREQ def2-TZVP 
		%maxcore 4000 
		%pal 
		nprocs 1 
		&#8203;结束</li>
		<li>修改每个配体的下载文件 .sh 作业文件，以包含唯一的作业名称和电子邮件地址。然后，使用以下命令将“stability”目录传输到高性能计算（HPC）系统： 
		ssh xsedeu0000@darwin.hpc.udel.edu 
		mkdir ~/4hco 
		&#8203;scp -r /local/path/to/stability xsedeu0000@darwin.hpc.udel.edu:~/4hco</li>
		<li>通过简单 Linux 资源管理实用程序（SLURM 高性能计算集群工作负载管理器）使用循环脚本执行作业： 
		for i in {1..50}; do 
		cd ~/4hco/stability/plk1_lig${i} 
		chmod +x job_lig${i}.sh 
		sbatch job_lig${i}.sh 
		&#8203;完成</li>
		<li>收到任务完成邮件后，进入配体文件夹并打开输出文件以查看数据，记录HOMO和LUMO值： 
		cd ~/4hco/stability/plk1_lig1 
		&#8203;nano lig1.out</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. ADMET-S 数据分析
<ol>
	<li>将来自 SwissADME 生物利用度和渗透性雷达图的理化性质数据合并到一个 .csv 文件中。
	<ol>
		<li>保存来自 SwissADME 的 .csv 文件，并将其命名为“Physiochemical.csv”。</li>
		<li>将“Physiochemical.py”脚本（补充文件 1）与“Physiochemical.csv”置于同一文件夹中并运行该脚本。</li>
		<li>应用以下标准：nHD：0–7，nHA：0–12，nStereo：&#60;2，LogP：0–3，LogD：1–3，LogS：–4 至 0.5，Fsp3：&#62;0.41，nHet：1–15。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从 SwissADME 获取吸收和分布数据。
	<ol>
		<li>截取并保存 SwissADME 中的 BOILED-Egg32 图表。</li>
		<li>应用以下标准：分子必须位于“蛋”区域内，并作为 P-糖蛋白抑制剂，优先选择红色点。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从 ADMETlab3.0 获取细胞色素（CYP）底物和抑制剂的代谢数据。
	<ol>
		<li>保存来自 ADMETlab3.0 的 .csv 文件，并将其命名为“Metabolism.csv”。</li>
		<li>编辑该 .csv 文件，仅保留 CYP-inh 和 CYP-sub 两列。</li>
		<li>将“Metabolism.R”脚本（补充文件 1）与“Metabolism.csv”置于同一文件夹中并运行该脚本。</li>
		<li>应用以下标准：优先选择 CYP p450 抑制剂且非底物（类别为 0）的分子。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从 ADMETlab3.0 获取血浆清除率和半衰期的排泄数据。
	<ol>
		<li>保存来自 ADMETlab3.0 的 .csv 文件，并将其命名为“Excretion.csv”。</li>
		<li>编辑该 .csv 文件，仅保留 cl-plasma 和 t0.5 两列。</li>
		<li>将“Excretion.py”脚本（补充文件 1）与“Excretion.csv”置于同一文件夹中并运行该脚本。</li>
		<li>应用以下标准：血浆清除率：0.01–5 ml/min/kg。</li>
		<li>从 Toxtree 获取毒性类别数据，从 ADMETlab3.0 获取毒发色团数量的毒性数据。
		<ol>
			<li>保存来自 ADMETlab3.0 的 .csv 文件，并将其命名为“Toxicity.csv”。</li>
			<li>编辑该 .csv 文件，仅保留 Toxicophore 列，并新增一列记录每个配体来自 Toxtree 的毒性类别。</li>
			<li>将“Toxicity.py”脚本（补充文件 1）与“Toxicity.csv”置于同一文件夹中并运行该脚本。</li>
			<li>应用以下标准：毒发色团数量为 0–2。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>从 ORCA 输出文件中获取稳定性数据（“ORBITAL ENERGIES”，特别是 HUMO 和 LUMO 能量值）。
		<ol>
			<li>创建一个 Excel 表格，将每个配体的 HUMO 和 LUMO 能量分别记录为独立列。</li>
			<li>新增一列用于计算带隙（HUMO–LUMO = 带隙）。</li>
			<li>将该 Excel 表格另存为“Stability.csv”。</li>
			<li>将“Stability.py”脚本（补充文件 1）与“Stability.csv”置于同一文件夹中并运行该脚本。</li>
			<li>应用以下标准：带隙差值在 3.6–5 eV 之间。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者声明无竞争利益。

本研究聚焦于一种探索性计算工作流程，通过虚拟筛选、分子对接和ADMET-S分析来鉴定和评估潜在的PLK1-PBD抑制剂。该流程能够根据预测的结合趋势和药代动力学特性有效优先排序化合物。在本方案中，鉴定出一组可能的PLK1抑制剂，并评估其对PLK1–3蛋白的ADMET性质和结合亲和力。该方案采用以疾病为导向的方法，从包含约73,400个化合物的数据库中筛选出50个分子（图9）。随后对这50个分子进行ADMET-S评估，计算其药代动力学和药效动力学特性、类药性以及稳定性。此外，还计算了这些分子对PLK1–3蛋白的结合亲和力，以评估其对PLK1的抑制效力及选择性。根据结果，若干分子表现出更理想的性质。后续药物发现研究可选择淘汰部分分子并重点研究其中少数候选物，或暂不进行早期淘汰，而在药物设计过程中后期利用这些结果优化ADMET性质。&#160;
聚焦于PLK1、PLK2和PLK3而排除PLK4与PLK5的生物学依据源于结构与功能两方面的考量。由于PLK4和PLK5在结构和功能上与PLK1存在显著差异，且其在癌症治疗中的相关性有限，因此未被纳入本研究。PLK1具有激酶结构域和Polo-box结构域（PBD），在调控有丝分裂事件中发挥关键作用，是癌症治疗的重要靶点41。相比之下，PLK4和PLK5在结构上具有明显差异：PLK4含有隐匿型Polo-box（CPB）而非经典的PBD，主要参与中心粒复制；而PLK5缺乏功能性激酶结构域，几乎仅在脑组织中表达3。鉴于它们与PLK1-PBD的结构相似性极低，且在癌症相关的有丝分裂失调中作用有限，纳入PLK4和PLK5将无法为PLK1-PBD抑制剂的选择性评估提供有意义的信息。因此，该筛选策略为评估选择性提供了具有生物学相关性和计算可行性的框架。值得注意的是，六个最优候选配体（10、13、14、32、43和47）表现出比已知抑制剂TQ和Allopole-A更优异的结合能及ADMET-S特性，提示其作为潜在PLK1-PBD调节剂的价值。
为支持稳健实施，特别是帮助初次接触计算药物发现工具的学生或研究人员，本文提供了关键检查点（亦见“实验方案”部分）、关键步骤及工作流程故障排除指南的总结，详见表1。该表格增强了流程的适应性；例如，若用户无法访问高性能计算（HPC）资源，可暂缓进行ORCA稳定性分析；若某网络服务器不可用，则建议使用SwissDock等替代方案。这种灵活性确保了该工作流程在不同机构环境中仍具可行性，同时保持科学严谨性，并凸显本研究作为一项包容性、双语化、面向教育的早期药物发现贡献的新颖性。尽管整个工作流程被设计为一个集成化流程，但若干关键步骤从根本上决定了其成败（见表1）。此外，配套视频配有同步英文字幕及美国手语（ASL）手语翻译员，旨在提供无障碍且不分散注意力的学习体验。手语翻译员的指令与屏幕操作在时间上精确同步，例如，先打出“下一步”手势，随后暂停，等待光标点击“Next”按钮。在4HCO准备步骤中，手语翻译员使用手指标注（“A”和“B”）引导链的选择，屏幕录制内容亦精确对应此操作。在SuperNatural 3.0筛选片段中，手语翻译员的窗口会调整大小并移至右上方，同时引导观众注意“pathway”图标，并在光标执行操作时暂停。这些设计选择确保聋人及听力障碍观众能够获得与听力正常的使用者相同的集成化、实时指导，有效复现了面对面、由教师指导的实验教学体验。
除了上述优势外，还有多种方法可以改进工作流程。首先，初始筛选步骤可以进行优化；除了以疾病为导向和聚类抽样的方法外，还可以从对天然产物数据库中所有分子进行对接模拟开始，以确定哪些化合物最适合与靶标蛋白结合。此外，为了准确预测结合亲和力，还需要更精确的估算方法。&#160; PRODIGY 用于计算蛋白-配体亲和力的“无静电”方法，是将相互作用中各类原子接触数（如碳-碳、氮-氮、氧-氧及其他原子）代入一个经过训练的多重线性回归模型中，并采用四重交叉验证进行拟合，该方法在多次研究中均与实验测得的亲和力数据表现出显著相关性42,43。&#160; 其他可选方法包括 FoldX44、fastDRH45、深度学习模型46以及结合高级采样技术的分子动力学模拟（MD），这些方法在预测结果上可能表现出不同程度的一致性，具体取决于各方法本身的准确性47。
另一个方面是，ADMET-S 评估中使用的各种软件工具会产生大量指标，而理解用于评估药物候选资格的每个指标至关重要。确保准确性的方法之一是将多种上市药物应用于该方案，以确定它们如何达到各项阈值。&#160; 在此背景下，毒性仍需进一步研究，因为分子不会仅基于如 Cramer 规则等复杂决策树得出的毒性谱型而被直接淘汰，许多现有可用的药物具有类似的分类。&#160; 即使结合毒性谱型分析，毒理警示结构（toxicophores）的数量也并不能完全反映毒性。&#160; 在此情况下，该工作流程的一个延伸方向是将小分子样品与现有药物进行对比分析，以辅助结果解读。&#160; 例如，研究人员在解释由量子力学（QM）计算得出的 HOMO–LUMO 能隙值所反映的稳定性时，参考了以往文献中关于 DFT 计算在当前乳腺癌药物（如 Tamoxifen48、Letrozole49 和 Cisplatin50）中的应用与观察结果。此前，类似的工作流程已被用于识别针对多种疾病/障碍靶点的潜在抑制剂51。最近，Stafford 等人6综述了针对 PLK1-PBD 的抑制剂设计策略及其在癌症治疗中的应用前景。最新的研究通过基于结构的药效团建模、虚拟筛选、分子对接、分子动力学（MD）模拟及生物学评价，识别出可同时靶向 PLK1-PBD 和 PLK4-PB3 的双靶点抑制剂52。Zhou 等人还利用 3D QSAR 药效团模型、ADMET 分析、骨架跃迁、分子对接和分子动力学（MD）方法，从海洋天然产物库中筛选出 PLK1-PBD 抑制剂53。
总体而言，本研究的新颖性体现在以下四个方面。第一，本研究采用双语计算方案，以美国手语和英语同时呈现，从而提升STEM领域（尤其是聋人和听力障碍学生与研究人员）的可及性与包容性。这种双语呈现方式在计算药物发现领域极为罕见，且符合加劳德特大学推动公平科学教育的使命。第二，尽管PLK1仍是一个极具吸引力的抗癌靶点，但目前尚缺乏利用整合的结构、能量及ADMET-S标准对PLK1、PLK2和PLK3进行选择性评估的严谨计算研究。以往大多数研究仅聚焦于激酶结构域的抑制作用，或缺乏比较性选择性分析。本研究通过提供一种针对三种PLK-PBD的初步探索性并行筛选方案，填补了这一空白，该方案采用筛选机制，优先选择对PLK1具有高亲和力且脱靶结合最小的化合物。第三，该工作流程在设计时充分考虑了效率与易用性，尤其适用于教学环境及资源有限的场景。整个流程从数据库筛选到ADMET-S评估均可在标准学术硬件（配备8 GB内存的笔记本电脑）上于两周内完成，所用软件均为免费的网络工具（CB-Dock2、PRODIGY、SwissADME、ADMETlab）。分子对接与结合亲和力计算耗时较短（每个配体约30秒）。最耗时的步骤是使用ORCA进行的量子力学（QM）稳定性分析，但该步骤可延后至后续阶段执行，或在高性能计算资源上运行，如文中所示。相关脚本具有模块化特点，仅需进行基本的命令行或Jupyter Notebook编辑，便于无缝整合至现有课程体系。运行时间适中：数据库筛选与Lipinski规则符合性检查仅需数分钟；在普通台式机上对约1,000个分子进行聚类耗时不到30分钟。所有软件工具均可免费用于学术用途，支持跨平台（Windows、macOS、Linux），且无需商业许可，显著降低了使用门槛。第四，所鉴定出的配体表现出与纳摩尔级相互作用一致的优良结合亲和力，同时具备理想的类药性、代谢稳定性及低毒性特征。多个候选化合物展现出对PLK1-PBD强效且特异的结合能力，并具有优良的ADMET-S性质，值得进一步验证。 通过 分子动力学模拟或 体外 检测方法
因此，除了其方法学上的实用性之外，本研究还展示了如何利用易于获取、开源且高效的计算工具作为起点，来应对高价值的生物医学挑战，同时促进包容性的科学培训。随着PLK1-PBD抑制剂在肿瘤学领域不断获得关注，该工作流程为早期药物发现提供了一个可重复且适合教学的蓝图。其灵活性使其适用于高中、本科及研究生阶段的教学环境，并为课程整合科研项目（CUREs）提供了良好基础，使学生能够获得真实且动手参与的研究机会。与仅依赖激酶结构域对接或单一蛋白筛选的流程不同，该方法能够同时评估PBD在PLK1–3之间的选择性，这一点至关重要，因为这三种蛋白具有超过&#62;38%的结构同源性，却发挥着不同的生物学功能。此外，通过在开放获取框架中整合聚类分析、ADMET-S预测和量子力学（QM）稳定性评估，相较于暴力虚拟筛选，该方法降低了冗余性并减少了候选化合物的淘汰风险。

Polo样激酶（PLKs）是一类蛋白激酶，其结构由一个N端结构域和一个包含一个或两个Polo-box结构域（PBD）的C末端组成1,2。&#160;这些Polo-box结构域的数量和功能多样性在不同的PLK家族成员之间存在差异。PLK1参与细胞分裂的S期、G2期和M期。在细胞周期中，PLK1在S期作为DNA损伤检查点发挥作用，在G2期则调控染色体凝集和中心体成熟。PLK1还促进细胞进入M期，随后推动纺锤体组装、后期启动以及胞质分裂3,4。PLK1的过表达会导致因中心体异常形成而引发的遗传不稳定性，从而破坏细胞周期调控，使细胞无法正常调节凋亡过程。&#160;这种过表达现象已在肺癌、头颈部癌、食管癌、胃癌、结直肠癌和乳腺癌中被观察到4。因此，通过靶向PBD的抑制剂抑制PLK1可能触发细胞凋亡5,6。该实验流程旨在实现高选择性，以避免抑制对神经系统功能和基因毒性应激管理至关重要的PLK2和PLK33。
在某些情况下，PLK2 作为肿瘤抑制因子发挥作用，调控 G1/S 期转换，并促进细胞周期蛋白 E 的降解，从而防止细胞不受控增殖。PLK3 在细胞周期调控和对基因毒性应激的响应中具有复杂作用，通过参与 DNA 损伤检查点激活和诱导凋亡，有助于维持基因组完整性7。重要的是，尽管抑制 PLK1 已成为癌症治疗中一种有前景的治疗策略，但 PLK2 和 PLK3 在神经系统功能和应激反应中的关键作用要求开发高度选择性的抑制剂，以尽量减少对这些重要激酶的脱靶效应3。这一生物学背景以及超过 38% 的序列同源性3凸显了发现特异性靶向 PLK1 泊洛盒结构域（PBD）化合物的重要性，同时避免干扰 PLK2 和 PLK3 在正常细胞生理中的保护功能。
已知的Polo样激酶（PLK）抑制剂，尤其是靶向PLK1的抑制剂，因其在癌症治疗中的潜在治疗应用而被广泛研究。已有多种化合物被开发并进入临床试验阶段，包括BI 2536、伏拉塞替布（volasertib，BI 6727）、昂凡塞替布（onvansertib，NMS-1286937）和GSK461364，这些化合物通常作为ATP竞争性抑制剂8,9,10。其他类型的抑制剂则靶向PBD结构域，包括百里醌（Thymoquinone，TQ）11,12、Poloxin13,14和Allopole-A15。尽管据报道具有前景，但由于存在诸如ADMET-S性质欠佳和脱靶效应等挑战，目前尚无获批的特异性PBD抑制剂或处于后期阶段的临床试验6。例如，据报道多种PLK1-PBD抑制剂为非特异性蛋白质烷基化剂16，限制了其临床应用。因此，提高潜在PLK1-PBD抑制剂的选择性和ADMET-S特性仍是药物发现中的关键目标。
本研究旨在利用虚拟筛选、结构相似性过滤、分子对接、结合能计算及 ADMET-S 评估，探索具有 ADMET-S 特性的潜在 PLK1-PBD 抑制剂。对 PLK2 和 PLK3 采用相同的流程，以评估其潜在选择性。尽管目前已存在多种用于激酶抑制剂发现的计算流程，但极少有方法能同时整合针对 PLK1–3 PBD 的选择性筛选、全面的 ADMET-S 分析以及量子力学稳定性分析，尤其是应用于天然产物库的研究更为罕见。该工作流程基于已建立的虚拟筛选范式，但经过优化，更便于教学使用，适用于早期假设的生成。本方案仅需一台标准笔记本电脑（8 GB 内存）、免费的学术软件，且无需编程基础，因此适用于高中、本科及研究生阶段的教学环境，包括基于课程的本科科研实践（CUREs）。
本研究的计算流程始于蛋白质准备，其中PLK1-PBD、PLK2-PBD和PLK3-PBD的结构从蛋白质数据库（PDB）中获取，或通过建模和处理以解决结构上的不一致。接下来进行天然产物数据库筛选，根据化合物作为抗乳腺癌药物的潜力及其是否符合里宾斯基五规则（Lipinski’s Rule of Five）进行过滤。随后，基于分子指纹和相似性将化合物聚类为50个代表性结构。这些代表性化合物随后进行蛋白-配体对接和结合亲和力计算，生成针对三种PLK蛋白的相互作用数据。接着，利用三个不同的网络服务器评估ADMET-S性质，以预测药代动力学、类药性、毒性及代谢稳定性。通过量子力学（QM）计算，采用最高占据分子轨道（HOMO）和最低未占据分子轨道（LUMO）分析HOMO–LUMO能隙，评估分子稳定性。最后，分析ADMET-S数据，根据理化性质、吸收、分布、代谢、排泄、毒性和稳定性等标准，对化合物进行筛选和排序，以确定潜在且选择性的PLK1-PBD抑制剂。

<table><tbody><tr><td>ADMETLab3</td><td>Simulations Plus. Inc</td><td>V3.0</td><td>ADMET性质</td></tr><tr><td>Alphafold</td><td>Google DeepMind &amp;amp; Isomorphic Labs (Alphabet子公司)</td><td>V3.0.1</td><td>三维蛋白质建模</td></tr><tr><td>Anaconda/Conda</td><td>Anaconda, Inc.</td><td>V24.9.2</td><td>开源包管理系统&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>CB-Dock2</td><td>Yang Cao实验室</td><td>V2.0</td><td>蛋白质-配体盲对接</td></tr><tr><td>CHARMM-GUI</td><td>理海大学</td><td>V3.8</td><td>生物分子操作与模拟</td></tr><tr><td>DARWIN on ACCESS</td><td>特拉华大学</td><td>N/A</td><td>高性能计算</td></tr><tr><td>ORCA</td><td>FAccTs GmbH</td><td>V6.1.0</td><td>量子化学计算软件包</td></tr><tr><td>Protein Data Bank</td><td>全球蛋白质数据库</td><td>RRID:SCR_006555</td><td>蛋白质数据库</td></tr><tr><td>RDKit</td><td>开源</td><td>RRID:SCR_014274</td><td>化学信息学编程</td></tr><tr><td>SuperNatural 3.0</td><td>柏林生理学与科学信息技术研究所</td><td>V3.0</td><td>天然分子库</td></tr><tr><td>SwissADME</td><td>瑞士生物信息学研究所</td><td>RRID:SCR_017865</td><td>ADME性质</td></tr><tr><td>Toxtree</td><td>Ideaconsult有限公司</td><td>V3.1.0</td><td>毒性分类</td></tr></tbody></table>

一种用于在美式手语和英语中识别潜在plk1抑制剂的双语计算工作流程

A Bilingual Computational Workflow for Identifying Potential PLK1 Inhibitors in American Sign Language and English

Polo样激酶1（PLK1）在细胞周期的S期、G2期和M期中发挥关键作用，其过表达在多种癌症（包括乳腺癌）中频繁出现，导致基因组不稳定性和凋亡调控失常。与靶向激酶结构域的传统ATP竞争性抑制剂不同，选择性抑制PLK1的Polo-box结构域（PBD）提供了一种有前景的策略，可破坏对有丝分裂进程至关重要的蛋白-配体相互作用，从而在癌细胞中触发凋亡。然而，PLK1与其同源蛋白（PLK2和PLK3）结构高度相似，而后者分别在神经功能和应激反应中起重要作用，因此必须具备极高的选择性，以避免脱靶效应。为应对这一挑战，本方案采用双语（美国手语和英语）计算流程，整合了虚拟筛选、结构聚类、蛋白-配体对接、结合亲和力预测、ADMET-S谱分析以及量子力学（QM）稳定性分析。从SuperNatural 3.0天然产物数据库出发，根据与乳腺癌的相关性及类药性标准筛选化合物，通过聚类确保化学多样性，并评估其与PLK1、PLK2和PLK3的PBD结构的相互作用。尽管虚拟对接和in silico ADMET-S评估无法最终确认选择性或作用机制，但本研究生成了可验证的假设，并优先筛选出一组来源于天然产物的候选分子，供后续进行分子动力学模拟、生化验证或实验性筛选。

本双语实验方案提供了一种计算药物发现工作流程，用于评估来源于数据库的天然分子与Polo样激酶1至3（PLK1–3）之间的蛋白-配体相互作用，及其吸收、分布、代谢、排泄、毒性和稳定性（ADMET-S）性质。

一种用于在美式手语和英语中识别潜在PLK1抑制剂的双语计算工作流程

Polo样激酶1（PLK1）在细胞周期的S期、G2期和M期中发挥关键作用，其过表达在多种肿瘤中频繁出现……

一种双语计算工作流程。引言。研究表明，PLK1 在多种癌症中过表达。通过 PLK1 的极体盒结构域（PBD）抑制其活性已被证明可诱导细胞凋亡。本研究的目标是鉴定具有理想药物特性和药代动力学性质的选择性PLK1-PBD抑制剂。对同源蛋白PLK2和PLK3采用相同的实验方案以评估其选择性。实验方案：靶标蛋白制备。在此，我们利用 CHARMM-GUI 对来自蛋白质数据库（PDB）的 PLK1（4HCO）进行优化。这一步骤可确保该蛋白质不存在任何缺失的残基或氢原子。接下来，我们将使用该工具继续操作。在输入生成器中，选择 PDB 阅读器操作器。向下滚动至输入框，确保已选择 PDB 选项，然后输入 PLK1 的编号 4HCO。在下一页中，取消选择蛋白链 B，仅处理链 A。点击继续。向下滚动至 PDB 信息部分，然后继续。在四个输出结果中，我们选择 PDB 文件并将其保存。最后，使用文本编辑器打开 PDB 文件。将组氨酸的质子化状态从 HSD 替换为 HIS。天然产物数据库筛选。获取靶向PLK1的小分子样本的方法采用天然产物数据库，分为三个步骤。天然产物数据库内容广泛，因此初始化合物的选择基于特定疾病及置信度阈值。本示例中使用的是SuperNatural 3.0。SuperNatural 3.0 可通过疾病选择获取分子。一种查询方式是通过人类通路。此处选择了乳腺癌。该通路的 KEGG ID 如下所示。然后我们将 KEGG ID 输入至 SuperNatural 3.0 通路中。或者，我们也可以点击“疾病”，选择乳腺癌，并保存完整的结果文件。在常见问题中，可以下载数据库的完整库。继续操作。继续解压压缩文件，获取 CSV 文件，并删除压缩包。打开 R Studio 或您选择的集成开发环境。在将数据导入 R Studio 后，初始完整结果包含 73,046 个分子。应用置信区间后，分子数量减少至 1,193 个。采用聚类抽样方法。使用 RDKit.Chem 软件包应用 Lipinski 五规则后，我们获得了 999 个分子。由此可见，我们共有 999 个分子。接下来，我们采用K-means聚类方法获得50个代表性分子。聚类基于Tanimoto相似性，并进行蛋白质-配体对接和结合亲和力计算。该方法的目标是将PLK1与每种配体进行对接以评估结合亲和力。请继续打开CB-Dock2，然后进入Dock标签页。此处我们上传 4hco.pdb 作为对接的目标蛋白。请上传一个配体。此处我们从配体一開始。或者，您可以键入或粘贴此 SMILES 字符串。请继续输入您的电子邮件地址，以便于数据收集。随后，点击“自动盲对接”。结果将通过电子邮件发送。请保存对接结果的压缩文件。保存后，解压该 zip 文件，其中包含多种文件。除 complex.pdb 文件外，删除所有其他文件。应存在一个默认的五个复合物的 pdb 文件。通过删除未解压的 zip 文件来清理目录。使用 CB-Dock2 完成蛋白质-配体对接（按 Vina 评分对构象进行排序）后，下一步是利用 PRODIGY 计算结合亲和力。通过 PRODIGY 计算结合亲和力可确保对蛋白质选择性进行具有竞争力的评估。理想情况是配体对 PLK1 具有选择性，而不作用于其结构同源物。前往 PRODIGY 网络服务器。选择 PRODIGY-LIGAND 选项卡。参考一个复合物。使用 pdb 文件确定蛋白质和配体链的标识符。用文本编辑器打开复合物的 pdb 文件。该蛋白质的链标识符为 P，需将其输入至网络服务器中。配体链通常以 HETATM 开头，搜索该位置即可。配体的链标识符为 A:UNL。该标识符将被输入到网络服务器中。每种蛋白质-配体组合提供的五个复合物将一次性上传。此任务使用在 R 中开发的文件管理脚本。该脚本将所有对接组合的 pdb 文件进行压缩。压缩后，文件被手动上传至 PRODIGY。继续提交 PRODIGY 配体。在上传的组合中，列出了每种五个构象的结合亲和力。Delta-Gnoelec 是排除静电计算后的结合亲和力评分。继续保存结果，结果将以压缩包形式保存。解压后，输出文件夹中包含亲和力评分。ADMET-S 评估。ADMET 评估（不含稳定性）涉及三种不同的工具。ADMET 利用超过 120 种性质来评估药物的可开发性与生物利用度。ORCA 采用密度泛函理论（DFT）来分析药物性质。继续操作。创建一个用于稳定性的目录。获取小分子的SMILES字符串。打开 Avogadro 或您选择的分子编辑器。使用 SMILES 字符串构建您的小分子。构建完成后保存分子。确保其位于稳定性子目录中。然后进行几何优化。接下来，生成一个ORCA输入文件。复制并粘贴所需的理论级别，例如从示例文档的第四行中所示的内容。接着替换默认的理论级别。然后生成文件。保存在此稳定性文件夹中。添加 sh 文件或 bash 作业文件。继续自定义作业文件的参数。例如，可自定义接收通知的电子邮件。代表性结果。首先，我们采用主成分分析（PCA）进行多维降维。该图显示了用灰色椭圆圈出的不同编号的簇。接下来是配体1与PLK1-PBD的结合结果。左上方为绿色显示的配体1的示意图，其中不理想的残基以红色和橙色标出。右侧是使用 CHARMM-GUI 进行清洗和准备后的代表性模型。下方是与 PLK1、PBD 及配体 1 对接形成的复合物。此外，CB-Dock2 展示了前五个对接空腔及其结合亲和力，以 Vina 评分形式呈现。PRODIGY 预测的结合亲和力可通过热图进行可视化展示。该热图描绘了同源蛋白 PLK1、2 和 3 的作用。红色表示较弱且不理想的亲和力，绿色则表示相反情况。ADMET-S 评估可以通过多种图形来表示。第一种是“煮鸡蛋图”，该热图通过绿色和红色分别标识配体针对不同代谢指标的抑制剂和非底物状态。为评估清除情况，可使用折线图展示药物在表达前完成分布的理想时间阈值。多种指标也可汇总成实用的雷达图。每个配体中的毒性基团数量可用柱状图表示。Toxtree 可输出基于 Cramer 决策树规则的药物毒性分类及定性推理结果。通过合适的 HOMO-LUMO 能隙阈值线形图，可展示分子的稳定性或反应活性。结论：综上所述，本实验方案适用于高中或本科阶段，整合了多种虚拟药物筛选、结合亲和力分析及 ADMET-S 工具。本方案产生的结果有望提高有利药物发现的产量。

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使用超高效液相色谱-高分辨质谱法（UPLC-HRMS）对生物来源样本进行非靶向代谢组学分析

了解用于识别PLK1潜在抑制剂的双语计算流程。该方法结合分子对接、PRODIGY结合亲和力计算和ADMET-S评估，帮助研究人员筛选具有理想成药性和生物利用度的候选化合物。

一种用于在美式手语和英语中识别潜在PLK1抑制剂的双语计算工作流程

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