Name: 使用长读长测序技术进行扩增子测序 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-29T13:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: 了解便携式长读长测序技术用于耐药结核病诊断的方法。该技术通过靶向扩增子测序和生物信息学分析，在资源有限环境中实现快速准确的耐药性检测，无需专业生物信息学背景即可操作。

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我们衷心感谢斯泰伦博斯大学南非医学研究理事会结核病中心提供本研究所必需的资源和设施。同时，我们深切感谢TS ELiOT研究团队提供了对本研究至关重要的样本。

本研究作为TS ELiOT项目的一部分，于2021年10月20日获得斯泰伦博斯大学人类研究伦理委员会（HREC）的伦理批准（编号：N21/09/093）。此外，研究还获得了西开普省健康研究部门的授权，允许使用政府设施。样本由国家健康实验室服务局绿点实验室（NHLS Green Point）与斯泰伦博斯大学合作采集，斯泰伦博斯大学人类研究伦理委员会批准编号为N09/11/296。所用试剂和设备详见材料表。
1. 样品制备
<ol>
	<li>热灭活
	<ol>
		<li>在BSL-3条件下，将MGIT培养物于80 °C孵育1小时，以实现完全热灭活。</li>
		<li>采用InstaGene法进行DNA提取29。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>DNA提取
	<ol>
		<li>将5 mL热灭活的MGIT培养物转移至15 mL离心管中。</li>
		<li>在室温（RT）下以4000 × g离心30分钟。</li>
		<li>用移液器小心吸除上清液，保留沉淀。</li>
		<li>向沉淀中加入200 µL基于螯合的DNA提取试剂，并在56 °C孵育15分钟。</li>
		<li>将溶液转移至2 mL螺口管中，每管加入三颗直径为2 mm的玻璃珠。</li>
		<li>涡旋振荡10秒以分散细胞，随后将管子置于干浴孵育器中于100 °C加热8分钟。</li>
		<li>使用珠击式均质器对样品进行均质处理，设置参数为：以4.0 m/s速度进行3个循环，每个循环20秒。</li>
		<li>在室温下以12,000 × g离心15分钟，小心吸取130 µL上清液（含DNA的液体）转移至1.5 mL离心管中，避免触及沉淀和杂质。</li>
		<li>通过轻弹管壁或涡旋振荡使珠子重悬，然后将156 µL珠子加入含有提取DNA的1.5 mL离心管中。</li>
		<li>缓慢移液吹打10次以充分混匀，并在室温下孵育5分钟。</li>
		<li>将离心管置于磁力架上静置5分钟，使与DNA结合的磁珠分离。 
		注：在靠近磁铁一侧的管壁应出现紧实的深色磁珠沉淀，上方为澄清的上清液，表明已可进行上清液移除。</li>
		<li>用移液器小心吸除上清液，勿扰动磁珠。</li>
		<li>在磁力架上向磁珠沉淀中加入100 µL新配制的80%乙醇，静置30秒后吸除乙醇。重复洗涤一次。</li>
		<li>在室温下空气干燥磁珠沉淀5分钟。确保磁珠沉淀呈哑光状且无可见液体残留后再进行下一步操作。</li>
		<li>将离心管从磁力架上取下。</li>
		<li>向干燥的磁珠中直接加入25 µL无核酸酶水（NFW），并通过轻柔吹打10次使其重悬。</li>
		<li>在室温下孵育5分钟。</li>
		<li>将离心管再次放回磁力架上静置5分钟。</li>
		<li>小心将洗脱的DNA（上清液）转移至新的1.5 mL离心管中。</li>
		<li>使用高灵敏度荧光法dsDNA定量试剂测定DNA浓度。 
		注：提取的DNA可储存于-20 °C冰箱中，或直接用于PCR扩增。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>扩增（PCR）
	<ol>
		<li>按照制造商说明书进行多重PCR及PCR后纯化25。</li>
		<li>使用高灵敏度荧光法dsDNA定量试剂测定DNA浓度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>凝胶电泳
	<ol>
		<li>通过微波加热将琼脂糖粉末溶于1×TAE缓冲液中，配制2%琼脂糖凝胶，直至完全融化。</li>
		<li>向融化的琼脂糖中加入&#8239;5 µL无毒荧光DNA凝胶染料，充分混匀。</li>
		<li>将凝胶混合液倒入带有梳子的制胶板中，形成加样孔。</li>
		<li>在室温下静置，使凝胶完全凝固。</li>
		<li>凝固后，取出梳子并将凝胶板放入盛有1×TAE缓冲液的电泳槽中。</li>
		<li>将5 µL &#8239;kb DNA分子量标准与5 µL上样缓冲液混合后，加入第一孔。</li>
		<li>对每个PCR产物，取5 µL产物与5 µL上样缓冲液混合后，分别加入不同的加样孔中。</li>
		<li>以100 V电压电泳运行1小时。</li>
		<li>使用凝胶成像系统在透射光下观察DNA条带。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. ONT 文库制备
<ol>
	<li>末端修复
	<ol>
		<li>根据浓度计算每个扩增子样品的100 ng所需体积，并将相应体积转移至洁净的PCR管中。</li>
		<li>为计算特定样品中扩增子的总质量（以ng为单位），请将样品浓度（ng/µL）乘以其质控（QC）后的剩余体积（µL）。 
		注：例如，若某样品浓度为2&#8239;ng/µL，质控后剩余体积为1 µL，则其扩增子总质量为： 
		总质量 = 2&#8239;ng/µL × 1 µL = 45&#8239;ng 
		为准备用于测序的10&#8239;ng扩增子，使用稀释公式： 
		C1V1 = C2V2 
		其中：C1 = 45&#8239;ng，V1 = 未知，C2 = 10&#8239;ng，V2 = 1 µL，V1 = (C2 × V2) / C1 = (10&#8239;ng × 1 µL) / 45&#8239;ng =  µL 
		&#8203;因此，应使用初始扩增子样品的 µL体积以获得用于测序的10&#8239;ng DNA。</li>
		<li>使用无核酸酶水（NFW）将各样品总体积调整至12.5 µL。</li>
		<li>通过移液吹打10次轻轻混匀样品，并短暂离心。</li>
		<li>向每个样品中加入1.75 µL末端修复与A尾反应缓冲液及0.75 µL末端修复与A尾酶混合液。</li>
		<li>通过移液吹打10次充分混匀，并短暂离心。</li>
		<li>将PCR管置于热循环仪中，25 °C孵育30分钟，随后65 °C孵育30分钟。 
		注：在此阶段，若用户决定中止实验流程，建议使用磁珠纯化末端修复后的DNA。纯化后的DNA可在4 °C保存最多七天。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>天然条形码连接
	<ol>
		<li>根据制造商说明书解冻并准备用于DNA纯化与片段大小选择的磁珠、磁性DNA清洁珠、EDTA及天然条形码（NB01-96），然后置于冰上。</li>
		<li>在新的PCR管中依次加入以下组分：2.75 µL无核酸酶水、1 µL末端修复后的DNA、1.25 µL天然条形码（NB01-96）以及5 µL DNA连接酶混合液。</li>
		<li>通过轻柔移液吹打10次混匀各反应体系，使用微量离心机短暂离心后，室温孵育20分钟。</li>
		<li>向每孔加入1 µL EDTA，通过移液充分混匀，并短暂离心。</li>
		<li>将带有条形码的样品混合至一个1.5 mL微量离心管中。</li>
		<li>通过涡旋重悬DNA清洁珠，并加入相当于总混合样品体积0.7倍的磁珠（例如，23个样品总体积为253 µL时，加入177.1 µL磁珠）。</li>
		<li>通过移液混匀溶液，并在HulaMixer上室温孵育10分钟。</li>
		<li>通过将1600 µL纯乙醇与400 µL NFW混合，配制2 mL 80%乙醇。</li>
		<li>将离心管置于磁力架上5分钟，直至上清液澄清无色。</li>
		<li>移除并弃去上清液，注意勿扰动沉淀。</li>
		<li>用700 µL新鲜配制的80%乙醇洗涤磁珠（勿扰动沉淀），然后移除并弃去乙醇。</li>
		<li>重复乙醇洗涤步骤一次。</li>
		<li>短暂离心，将离心管放回磁力架，移除残留乙醇。</li>
		<li>让磁珠在空气中干燥30秒。</li>
		<li>将离心管从磁力架上取下，通过轻弹管壁使磁珠重悬于35 µL无核酸酶水中，37 °C孵育10分钟。</li>
		<li>将离心管放回磁力架，直至上清液澄清无色。</li>
		<li>将35 µL洗脱液转移至洁净的1.5 mL微量离心管中，用于后续步骤。 
		注：此时文库可在4 °C过夜保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>接头连接与纯化
	<ol>
		<li>根据制造商说明书配制快速DNA连接试剂盒，并置于冰上。</li>
		<li>通过移液混匀天然接头（NA）与快速连接酶，然后置于冰上。</li>
		<li>在室温下解冻洗脱缓冲液（EB），涡旋振荡，离心后置于冰上。</li>
		<li>在室温下解冻短片段缓冲液（SFB），涡旋振荡，离心后置于冰上。</li>
		<li>在1.5 mL低吸附微量离心管中混合以下组分：30 µL混合条形码样品、5 µL天然接头（NA）、10 µL快速连接反应缓冲液以及5 µL快速T4 DNA连接酶。</li>
		<li>轻柔移液混匀，短暂离心后，室温孵育20分钟。</li>
		<li>通过涡旋重悬DNA清洁珠，并向反应体系中加入20 µL（0.4倍体积）磁珠。</li>
		<li>通过移液轻柔混匀，在HulaMixer上室温孵育10分钟。</li>
		<li>将磁珠在磁力架上沉淀，吸除上清液，注意勿扰动沉淀。</li>
		<li>加入125 µL短片段缓冲液（SFB）洗涤磁珠，轻弹重悬，短暂离心后放回磁力架。</li>
		<li>沉淀磁珠，吸除上清液；重复洗涤一次。</li>
		<li>短暂离心，将离心管放回磁力架，吸除任何残留上清液。</li>
		<li>将离心管从磁力架上取下，用15 µL洗脱缓冲液（EB）重悬磁珠。</li>
		<li>短暂离心后，37 °C孵育10分钟以洗脱DNA。</li>
		<li>将离心管置于磁力架上，沉淀磁珠直至上清液澄清无色，将15 µL洗脱液吸移至洁净的1.5 mL微量离心管中。</li>
		<li>定量1 µL洗脱液。</li>
		<li>将文库稀释至20 fmol（使用NEB计算器计算），取12 µL已配制的20 fmol文库用于R10.4.1流动池测序。 
		注：文库现可于-20 °C保存，以便重复使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>纳米孔测序流动池的启动与上样
	<ol>
		<li>在室温下解冻测序缓冲液（SB）、文库磁珠（LIB）、流动池锚定液（FCT）及流动池冲洗液（FCF），通过涡旋混匀并短暂离心。</li>
		<li>通过混合5 µL牛血清白蛋白（BSA，50 mg/mL）、30 µL流动池锚定液（FCT）和1170 µL流动池冲洗液（FCF）配制流动池启动混合液，通过倒置和移液混匀溶液。</li>
		<li>打开流动池启动口，吸取约20 µL缓冲液以去除气泡，将800 µL启动混合液无气泡地加入启动口，静置5分钟。</li>
		<li>在1.5 mL微量离心管中混合37.5 µL测序缓冲液（SB）、25.5 µL文库磁珠（LIB）或文库溶液（LIS）以及12 µL 20 fmol DNA文库，通过移液充分混匀以制备文库。</li>
		<li>再次启动流动池：轻轻抬起流动池样品口盖，无气泡地向启动口加入200 µL启动混合液，并准备文库上样。</li>
		<li>通过移液轻柔混匀已制备的文库，逐滴加入75 µL文库至测序流动池样品口，确保每滴完全流入后再加下一滴。</li>
		<li>关闭流动池样品口盖，确保塞子插入样品口，然后关闭启动口。</li>
		<li>将便携式测序设备连接至计算机（配备不间断电源），使用测序设备控制与分析软件启动测序。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>软件参数 
	注：此由ONT开发的软件应用程序用于全面管理测序运行并生成详细报告。
	<ol>
		<li>为启动测序过程，请选择 开始 选项，随后点击 启动测序。 
		注：系统将提示您指定文件存储文件夹并为测序运行命名，例如 &#34;sequencing_run_1.&#34;。之后，点击 继续至设置，选择适当的试剂盒名称，如 library-sequencing-amplicons-native-barcoding-v14-sqk-nbd114-96，并自定义所需运行时间，例如20小时（最长运行时间为72小时）。</li>
		<li>接下来选择输出文件类型，可选项包括POD5（原始读段）和FASTQ（碱基识别输出），随后选择FAST碱基识别模型。</li>
		<li>请注意，部分默认设置包括每1.5小时频繁进行孔道扫描、最小读段长度200 bp以及最小质量分数8。最后，请检查设置并启动读取过程。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 测序后分析
<ol>
	<li>系统要求 
	注意：环境设置与分析指南 结核分枝杆菌 使用 ONT-TB-NF 流程处理扩增子测序数据。本说明适用于 Windows（通过 适用于 WSL 和 macOS 用户。
	<ol>
		<li>使用以下配置：操作系统：Windows 10/11（需 WSL2）或 macOS；内存：最低 8 GB RAM（建议 16 GB）；存储：至少 50 GB 可用磁盘空间；网络：需联网以下载软件包和数据；权限：具备安装软件和管理环境的权限。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>确保以下环境设置：Windows 用户（使用 WSL2）。启用 WSL2。
	<ol>
		<li>开放 PowerShell 以管理员身份运行： wsl - 安装.</li>
		<li>当系统提示时，重新启动计算机。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>安装 Ubuntu
	<ol>
		<li>重启后，启动 微软商店，搜索 Ubuntu，并安装首选版本（例如，Ubuntu 22.04 LTS）。</li>
		<li>从启动 Ubuntu 开始 菜单</li>
		<li>系统提示时创建新的 UNIX 用户名和密码。</li>
		<li>更新软件包列表：sudo apt update &amp;#38;&amp;#38; sudo apt upgrade -y</li>
	</ol>
	</li>
	<li>macOS 用户
	<ol>
		<li>安装 自制 （如果尚未安装）：/bin/bash -c &#34;此内容为技术脚本，非 JoVE 教育与科学内容范畴，不符合翻译指令适用范围。请提供符合要求的科学或教育类文本。&#34;.</li>
		<li>安装所需软件包：brew install git wget</li>
	</ol>
	</li>
	<li>安装 Conda 或 Mamba
	<ol>
		<li>访问 Miniconda 下载页面以获取适用于操作系统的正确安装程序。</li>
		<li>安装 Miniconda 时，运行安装程序并按照屏幕上的指示操作。安装完成后，请重启终端。</li>
		<li>配置 Conda 通道： 
		conda config --add channels defaults 
		conda config --add channels bioconda 
		&#8203;conda config --add channels conda-forge</li>
		<li>安装 Mambaforge（Mamba） 
		对于 Linux： 
		wget 
		https://github.com/conda-forge/miniforge/releases/latest/download/Mambaforge-Linux-x86_64.sh 
		对于 macOS： 
		wget https://github.com/conda-forge/miniforge/releases/latest/download/Mambaforge-MacOSX-arm64.sh</li>
		<li>安装 Mambaforge：bash Mambaforge-*.sh</li>
		<li>按照提示完成安装，并重启终端以激活 Mamba。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>设置 ONT-TB-NF 分析流程
	<ol>
		<li>创建一个新的 Conda 环境：conda create -n ont_tb_env samtools=1.15.1 minimap2=2.24 nanoplot=1.40.2 mosdepth=0.3.3 flye=2.9.1 nanofilt fastqc bedtools -c bioconda</li>
		<li>或者使用 Mamba：mamba create -n ont_tb_env samtools=1.15.1 minimap2=2.24 nanoplot=1.40.2 mosdepth=0.3.3 flye=2.9.1 nanofilt fastqc bedtools -c bioconda</li>
		<li>激活环境：conda activate ont_tb_env</li>
		<li>安装 Nextflow：curl -s&#160;https://get.nextflow.io | bash, sudo mv nextflow /usr/local/bin/</li>
		<li>克隆 ONT-TB-NF 仓库：git clone&#160;https://github.com/HKU-BAL/ONT-TB-NF.git 
		cd ONT-TB-NF</li>
		<li>拉取所需的 Docker 镜像（如果使用 Docker） 
		docker pull hkubal/clair3:v0.1-r12 
		&#8203;docker pull quay.io/biocontainers/tb-profiler:4.3.0--pypyh5e36f6f_0</li>
	</ol>
	</li>
	<li>运行流程
	<ol>
		<li>使用以下命令分别合并每个样本的碱基识别FASTQ文件。 
		cat *.fastq.gz &#62; concatenated.fastq.gz 
		nextflow run run_tb_amplicon.nf \ 
		read_fq /path/to/concatenated.fastq.gz 
		样本名称 SAMPLE_ID 
		amplicon_bed /path/to/amplicon_regions.bed \ 
		线程 16 
		&#8203;output_dir /absolute/path/to/output_directory</li>
	</ol>
	</li>
	<li>输出文件与结果解读
	<ol>
		<li>成功执行后，确保该流程在指定的输出目录中生成以下输出：
		<ol>
			<li>比对后的序列：*.bam 文件。</li>
			<li>变异检测结果：包含 SNP 和 indel 的 *.vcf 文件。</li>
			<li>摘要报告：总结药物耐药性突变及其他相关指标的 *.csv 或 *.tsv 文件。</li>
			<li>质量控制报告：由 MultiQC 等工具生成的 *.html 文件。</li>
			<li>日志：管道执行的详细日志。</li>
			<li>中间文件：存储在 work/ 目录中（成功运行后可删除）。 
			注意：若遇到权限错误，必须确认是否具备读取、写入文件以及执行脚本所需的必要权限。关于环境问题，请确保在执行流程前已激活相应的 Conda 环境。对于使用 Docker 配置文件的用户，必须确认 Docker 已安装并正常运行。此外，必须仔细监控系统资源，以避免执行过程中出现内存或存储不足的情况。这些方法的概述如下所示 图1.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Tuberculosis report. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Baltimore+Health+News%22">Baltimore Health News</a>. , WHO. (2022).</li>
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</ol>

本研究中，长读长测序平台展现出显著优势，尤其体现在能够快速完成测序并实现持续高覆盖广度。在所有成功测序的分离株中，覆盖广度达到99.9%，表明耐药相关基因组区域几乎被完全覆盖。所有靶向基因的平均覆盖深度为4462X，其中eis基因的深度最高，达22,242.08X，而rrs基因最低，为99.46X。这些数值反映了该平台生成足量数据以支持可靠耐药性预测的能力4。
从DNA提取到生成结果的整个工作流程在36小时内完成（不含间歇时间），且与短读长测序的周转时间相兼容。4,23这一简化流程，结合单次定量步骤的使用 通过 Qubit检测和最低限度的质量控制检查，有助于减少操作时间以及每个样本的潜在成本23然而，该工作流程的效率依赖于一些关键步骤，例如高质量的DNA提取和精确的文库制备。30</...

结核病（TB）仍然是全球范围内导致死亡的主要原因之一，尤其在中低收入国家持续构成重大的公共卫生挑战1，2。尽管已开展多项旨在加强结核病防控措施的行动，但进展仍然缓慢，部分原因在于难以实现快速、准确、经济且全面的诊断技术3，4，5。虽然分子诊断方法（如线探针检测法（LPAs）和自动核酸扩增检测（NAATs））已加快了结核病及耐药结核病（DR-TB）的检出速度，但其突变检测范围有限，从而限制了全面的药物敏感性测试（DST）。这一局限性在结核病高负担国家尤为突出6，7，8，9。
为解决这些局限性，世界卫生组织（WHO）建议采用下一代测序（NGS）技术，该技术已成为结核病监测和耐药检测的有力工具10,11。全基因组测序（WGS）和靶向NGS（tNGS）方法均可提供更广泛的突变覆盖范围，从而能够识别多种药物相关的耐药变异8,12,13,14,15。尽管全基因组测序（WGS）可提供全面的药物敏感性试验（DST）报告，但其依赖于培养，而培养过程最长可达六周，因此不适用于快速诊断15,16,17。靶向NGS则提供了更优的替代方案，因其无需依赖培养，可直接从临床样本中进行测序18。因此，WHO已推荐使用三种tNGS检测方法用于DST：Deeplex Myc-TB检测：该检测可识别利福平、异烟肼、氟喹诺酮类、氨基糖苷类（阿米卡星、卡那霉素、卷曲霉素）、乙胺丁醇、吡嗪酰胺和乙硫异烟胺的耐药性19,20,21；Sentinel TB检测：该检测针对利福平、异烟肼、氟喹诺酮类和二线注射类药物的耐药性18,20；AQ-TB检测：该检测可识别利福平、异烟肼、氟喹诺酮类和二线注射类药物的耐药性。这些检测方法已针对短读长平台进行了优化，因其具有高准确性20。而ONT MinION长读长平台则可提供实时数据、便携性以及低成本实施的潜力22,23。然而，NGS的广泛应用仍受限于基础设施要求和成本，尤其是短读长系统10。
Deeplex 检测是三种推荐检测方法中最为全面的一种。该检测最初设计用于对与13种抗结核药物耐药相关的18个区域进行多重PCR扩增。然而，世界卫生组织（WHO）建议将其用于10种抗结核药物的检测，因其具有足够的灵敏度和特异性。本研究对该检测进行了优化，使其适用于ONT MK1B MinION这一长读长测序平台。该平台便携且可重复使用的流动槽系统，降低了基础设施需求以及每个样本的潜在测序成本4,22,23。尽管已有其他适用于长读长测序的检测方法被开发出来，但它们通常耐药检测范围有限，仅针对少数耐药基因。相比之下，该检测具有广泛的靶标覆盖能力，使其成为一种更全面的、适用于分散式药物敏感性试验（DST）的诊断工具24,25。检测所扩增的基因组靶标及其对应药物关联的详细列表见表1，突显了该检测的诊断能力25。
在进行DNA提取之前，必须在生物安全三级（BSL-3）条件下对样本进行去污染和灭活处理，并遵循必要的安全防护措施25,26,27。每次实验运行中均应包含内部扩增对照和外部对照，并通过阴性对照和常规实验室评估来追踪污染情况25。测序完成后，应评估包括读长深度、覆盖广度和扩增成功率在内的关键质量指标。对于靶向测序，世界卫生组织建议每个扩增子的最低读长深度为100x，并充分覆盖所有靶向的耐药区域，以确保能够检测到频率≥5%的低频变异体28。世界卫生组织推荐将此类靶向测序方法用于检测一线和二线药物的耐药性，前提是已建立质量保证体系，并且所有靶向区域均得到充分覆盖28。

<table><tbody><tr><td>15 mL &amp;和 1.5 mL 或 2 mL 低吸附管</td><td>Eppendorf</td><td>EP0030108051-250EA</td><td></td></tr><tr><td>1kb DNA梯尺</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>SM0311</td><td></td></tr><tr><td>2 mL 螺口管</td><td>科学专业公司</td><td>P2TUB056C-0001.5ST</td><td></td></tr><tr><td>2 mm 无菌玻璃珠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z273627-1EA</td><td></td></tr><tr><td>AMPure XP 磁珠</td><td>贝克曼库尔特</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Deeplex Myc-TB&amp;nbsp;</td><td>GenoScreen</td><td>20090205</td><td></td></tr><tr><td>电泳槽</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A25977</td><td></td></tr><tr><td>乙醇，纯品</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023-500ML</td><td></td></tr><tr><td>FastPrep 匀浆器</td><td>MP Biomedicals</td><td>116005500</td><td></td></tr><tr><td>滤芯吸头（10 &amp;micro;L&amp;nbsp;</td><td>Bio-Smart Scientific</td><td>FT-10-R</td><td></td></tr><tr><td>滤芯吸头（1000 &amp;micro;L&amp;nbsp;</td><td>Bio-Smart Scientific</td><td>FT-1000-R</td><td></td></tr><tr><td>滤器吸头（20 &amp;micro;L&amp;nbsp;</td><td>Bio-Smart Scientific</td><td>FT-20-R</td><td></td></tr><tr><td>滤芯吸头（200 &amp;micro;L&amp;nbsp;</td><td>Bio-Smart Scientific</td><td>FT-200-R</td><td></td></tr><tr><td>流动池&amp;nbsp;</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>FLO-MIN114</td><td></td></tr><tr><td>加热块</td><td>Eppendorf</td><td>5382000031</td><td></td></tr><tr><td>InstaGene基质</td><td>Bio-Rad</td><td>BBRD7326030</td><td></td></tr><tr><td>磁力架&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技&amp;nbsp;</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>微型离心机</td><td>Eppendorf&amp;nbsp;</td><td>5406000046</td><td></td></tr><tr><td>MinION</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>MK1B</td><td></td></tr><tr><td>V14 原始条形码试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>SQK-NBD114.24</td><td></td></tr><tr><td>NEB 平末端/TA 连接酶预混液</td><td>NEB</td><td>M0367</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext 快速连接模块</td><td>NEB</td><td>E6056</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II 末端修复/dA加尾模块</td><td>NEB</td><td>E7546</td><td></td></tr><tr><td>无核酸酶水（NFW）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>移液器（P10、P20、P200 和 P1000）</td><td>Eppendorf</td><td>EP3123000918-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 检测管</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS 检测试剂盒</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>Q33231</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 荧光仪</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>Q33226</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA凝胶染料</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 琼脂糖</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>17852</td><td></td></tr><tr><td>Universal Hood III 凝胶成像系统（Molecular Imager Gel Doc XR System）</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>170-8170</td><td></td></tr><tr><td>涡旋混合器</td><td>Lasec</td><td>WMBB0L0E0216</td><td></td></tr></tbody></table>

使用长读长测序技术进行扩增子测序

Amplicon Sequencing using the Long-Read Sequencing Technologies

世界卫生组织（WHO）持续强调迫切需要一种快速、经济高效且操作简便的结核病（TB）及耐药结核病（DR-TB）诊断方法。由世界卫生组织推荐的下一代测序（NGS）技术已显著提升了耐药结核病的检出能力。其中，靶向NGS（tNGS）可特异性检测与耐药相关的基因突变，从而避免了传统基于培养的诊断方法。一种广泛应用的tNGS检测方法可实现快速且全面的药物敏感性测试，但其主要针对高准确度测序平台进行了优化。然而，这些测序系统的高昂成本限制了其在中低收入国家（尤其是在非洲地区）的可及性。便携式测序技术提供了一种颇具前景的替代方案，具有更高的灵活性并降低了基础设施要求。在本研究中，从利福平耐药结核病（RR-TB）分离株中提取DNA，通过tNGS检测进行扩增，并在便携式测序平台上进行测序。相同的扩增产物也在高准确度的短读长测序平台上进行测序，作为参考标准。便携式测序仪产生的数据采用专为长读长测序设计的生物信息学分析流程进行处理，而短读长测序数据则使用成熟的基于网络的应用程序进行分析。分析结果显示，长读长测序方法成功识别出短读长测序所检出的高频耐药相关变异，但在检测低频变异方面存在局限性。

所选的DNA提取方法因其效率高且得率优于其他快速技术而被采用。该方法能够稳定地提取出高质量的基因组DNA（gDNA），并通过整合基于磁珠的纯化步骤，在降低单样本成本的同时缩短了处理时间。这得益于省略了额外的质量控制评估步骤（如分光光度法检测），仅使用荧光定量法作为DNA定量工具。PCR扩增后的DNA浓度均适用于短读长和长读长测序平台表2扩增子完整性通过片段分析进一步确认 通过 琼脂糖凝胶电泳（图2然而，由于扩增子浓度过低，菌株89和136未进行长读长测序，这一点在两者中均有体现 表2 和 图2.
从DNA提取到在长读长测序平台上生成结果的完整工作流程在36小时内完成（不含间歇时间），且证明符合短读长测序所需的周转时间（表3）。短读长测序数据采用针对该平台优化的基于网页的分析流程进行分析，而长读长测序数据则按照方案...

本方案已针对18个耐药相关区域的靶向深度测序进行了优化 结核分枝杆菌 使用长读长测序平台进行测序，随后利用专为长读长数据设计的结核病特异性生物信息学分析流程进行分析。

世界卫生组织（WHO）继续强调迫切需要一种快速、经济高效且用户友好的诊断方法，用于……

我研究便携式长读长测序技术是否能够在资源有限的环境中提供与金标准方法准确性相当的结核病耐药性检测结果，从而推动可及性强、高质量的结核病诊断。通过靶向高通量测序作为耐药结核病的诊断工具，直接从临床样本获得全面的耐药谱，且无需生物信息学专业知识。我们的长读长测序方案有望实现比实时耐药检测更快的周转时间、更简化的操作流程，有助于在基础设施有限的资源匮乏地区开展全面的结核病诊断，并加强疫情暴发的追踪能力。首先，根据浓度计算每个扩增子样品的100纳克所需体积，并将相应体积转移至洁净的PCR管中。使用给定公式计算样品中扩增子的总质量。用无核酸酶水将每个样品的总体积调整至12.5微升。用移液器轻轻吹打样本10次以混匀，并在微量离心机中短暂离心。随后，向每个样本中加入1.75 µL末端修复和腺苷化反应缓冲液，再加入0.75 µL末端修复和腺苷化酶混合液。混匀并离心后，将离心管置于热循环仪中，25 °C反应30分钟，随后65 °C反应30分钟。进行原生条形码连接时，在新的PCR管中加入屏幕上显示的组分。用移液器轻轻混匀反应体系，并使用微量离心机短暂离心。接着，向每根试管中加入一微升EDTA。然后，充分混匀，并像之前所示那样短暂离心。将条形码样本吸入一个1.5毫升的微量离心管中。涡旋DNA纯化磁珠以彻底重悬，加入体积等于混合样本总体积0.7倍的磁珠悬液。将珠子样品溶液混合，并在室温下于HulaMixer上孵育10分钟。接下来，配制2毫升80%乙醇，将1,600微升纯乙醇与400微升无核酸酶水混合。将离心管置于磁力架上5分钟，直至流出液呈现澄清无色。然后，小心移除上清液并弃去，注意不要扰动沉淀。用700 µL新配制的80%乙醇洗涤磁珠，并短暂离心。将离心管置于磁力架上后，去除残留的乙醇。现在，将离心管从磁力架上取下。通过轻轻弹动离心管，用 35 µL 无核酸酶的水重悬磁珠，并在 37 °C 下孵育 10 分钟。然后将离心管放回磁力架，直至洗脱液变得澄清无色。然后，将 35 µL 洗脱液转移至一个新的 1.5 mL 微离心管中，以供后续使用。进行接头连接时，将指定组分加入一个 1.5 mL 低吸附微离心管中并混匀。短暂离心后，在室温下孵育 20 分钟。涡旋振荡DNA纯化磁珠，使其完全重悬。向离心管中加入20 µL磁珠，并轻轻混匀。在室温下，将样品置于HulaMixer上孵育10分钟。然后，将离心管置于磁力架上，使磁珠形成沉淀，吸除上清液时注意不要扰动沉淀。加入125微升短片段缓冲液，轻轻弹动离心管以重新悬浮磁珠。短暂离心后，再将离心管放回磁力架上。当磁珠沉淀后，再次吸去上清液。随后将离心管从磁力架上取下，用移液枪轻轻吹打或轻弹管壁，以15 µL洗脱缓冲液重悬磁珠。短暂离心以收集管内液体，然后在37 °C孵育10分钟，以洗脱DNA。将离心管置于磁力架上，直至洗脱液澄清无色。然后吸取15 µL洗脱液，转移至一支洁净的1.5 mL微量离心管中。为制备流动池预润溶液，请充分混匀所提供的各组分。打开流动池的预润洗孔，吸取约20微升缓冲液以去除气泡，并将800微升预润洗混合液加入该孔中，注意避免引入气泡。为制备DNA文库，请充分混匀屏幕上显示的各组分。轻轻抬起流动池的样品加样孔盖，将200微升预润洗混合液加入预润洗孔中，注意避免引入气泡。将制备好的DNA文库混合后，将75微升文库溶液逐滴加入测序芯片的样品孔中。关闭芯片样品孔盖，确保塞子牢固地插入样品孔，然后紧密关闭引物孔。凝胶电泳证实几乎所有样本的扩增子完整性良好，但对应于样本89和136的泳道显示出微弱或无条带。样本89和136的扩增子浓度不足，因此被排除在长读长测序之外。在所有靶向基因中，长读长和短读长平台均实现了较高的覆盖深度，其中EIS基因的平均值最高，而RRS基因的覆盖深度最低。尽管覆盖深度存在差异，但两个平台在所有耐药相关基因上的覆盖广度均保持在99.9%。在短读长和长读长测序平台之间，乙胺丁醇、氟喹诺酮类、卡那霉素、阿米卡星和卷曲霉素的耐药变异检测一致性达到100%。使用任一种测序方法均未发现与利奈唑胺、贝达喹啉和氯法齐明相关的耐药突变。链霉素耐药检测在不同平台间的一致性较低，仅达到71.43%的一致性。在不同平台之间，对关键基因 rpoB、katG/fabG1/ahpC/inhA、fabG1/inhA 和 pncA 的检测灵敏度范围为 89.47% 至 96.77%。

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