Name: 通过实验设计和自动化工作流程实现基因编码生物传感器设计空间的高效采样 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-17T12:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: 了解基因编码生物传感器的自动化优化方法，通过实验设计和自动化筛选技术识别高灵敏度候选变体。该方法整合自动化文库生成与评估流程，显著提升遗传电路设计效率。

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GAG 和 PLR 获得了英国生物技术和生物科学研究生理事会（BBSRC）博士培训项目资助（BB/M011208/1）。MC 获得了 BBSRC 响应模式资助（BB/P01738X/1）。我们还要感谢亨利·罗伊斯先进材料研究所（通过 EPSRC 资助号 EP/R00661X/1、EP/S019367/1、EP/P025021/1 和 EP/P025498/1 提供资金）提供设施使用权限&#160;，以及 MBEC 英国研究与创新署（UKRI）工程生物学任务奖（BB/Y00812X/1）提供的技术支持与培训。

作者声明无利益冲突。

包含广泛遗传变异性的遗传元件文库对于基于实验设计（DoE）方法的成功至关重要。如文中所示 图2A，理论变异体的数量随着需靶向突变的位点数量以及随机化程度的增加而增加，这种不断扩大的文库规模导致了显著的筛选瓶颈。减少靶向位点数量或降低随机化程度可减少需要筛选的变异体数量，若需要更精确地调控或当存在重大限制时，这是一种具有吸引力的策略 先验的 已有对该系统的深入了解可作为指导。然而，对于生物传感器等具有大量重叠特征或遗传元件尚未充分表征的系统而言，很难规避对文库规模的需求。使用自动化液体处理设备可显著简化挑取菌落和培养变异株的工作，尤其是在需要收集更多数据点以绘制更复杂的功能曲线（如剂量-反应曲线）而非仅比较两个数据点（如开关状态）时。尽管难以精确量化引入自动化工作流程所节省的时间，但其主要优势在于能够将节省的时间用于开展其他并行实验。38.
尽管如此，在文库规模超过 104 的许多情况下，即使借助液体处理仪的方法也变得不切实际39。在这种情况下，使用流式细胞仪对变异体进行初步筛选是一种极具吸引力的方法，其分选通量可高达每小时 107 个细胞40。在对生物传感器的高性能变异体进行更全面的表征之前，通常采用荧光激活细胞分选（FACS）技术，结合两轮阳性筛选和至少一轮阴性筛选来进行优先级排序16,26,42。有关利用 FACS 开发和实施此类方案的详细综述已在其他文献中报道31。使用基于微孔板的液体处理仪检测方法也可实现初步筛选，如上述方案所述；通过比较在单一效应分子浓度下的开/关（ON/OFF）数据（如图 3D所示），仅选择功能显著增强（方法中定义为至少 3.6 倍）的变异型生物传感器进入后续深入表征，从而简化文库构建并缩短实验周期。然而，FACS 和液体处理仪平台均需要实验室投入较高的资金成本，且通常需要具备一定的技术专长才能操作和维护。基于琼脂平板的筛选方法则具有较低的技术和经济门槛，已与gfp荧光筛选或蓝白斑筛选结合使用，用于根据荧光强度选择核糖体结合位点（RBS）文库变异体以及酶突变体43,44。然而，这些方法在可有效筛选的变异体数量上同样受限，并且需要荧光信号之间存在显著差异才能被检测到44。作为一种在完全组合式、同时对多个元件进行突变策略之间的折中方案，&#34;分而治之&#34;的方法旨在将大规模变异文库划分为更易于管理的筛选模块41。尽管模块化策略可能具有实用性，但由于生物元件的性能已知高度依赖于上下文环境，尤其是在转录与翻译偶联普遍存在的细菌中，该方法无法有效探索组合设计空间，可能导致最终的设计选择陷入局部最优而非全局最优。
尽管转运和特异性诱导物的识别并非本方案的主要重点，但它仍是生物传感器开发中另一个值得关注的重要特征。针对目标分子缺乏合适的转录因子（aTF）是研究人员面临的一个重大挑战。合理选择能够结合目标效应物结构类似物的现有aTF，可为应用密码子随机化技术以调整aTF对目标效应物的特异性提供理想模板17。将目标序列与已解析的结构或AlphaFold预测结果进行比对，有助于识别效应物结合位点，并对疑似参与结合的氨基酸残基进行半理性随机化与排序，该策略可适配于本实验流程17。类似地，选择并调控负责效应物进出的转运蛋白，可显著改变生物传感器的剂量-响应特性。研究发现，转运蛋白基因的表达在生物传感器响应中起着关键作用；通过构建包含多样化Ptac启动子和核糖体结合位点（RBS）的文库来调控MucK转运蛋白的表达，可在多轮FACS筛选中稳定其表达水平，从而增强生物传感器响应的稳健性17。同样，直接筛选不同的转运蛋白本身也可调节生物传感器的特异性；利用原儿茶酸（PCA）响应型生物传感器筛选一组假定的PcaK转运蛋白，成功鉴定出两种 uniquely 能够摄取3,5-羟基化底物的转运蛋白，从而扩展了该系统可检测化合物的范围24。
将实验设计（DoE）原理与深度学习模型相结合后，自动化平台可成为更强大的表征与探索工具46,47。在利用高通量平台初步探索生物传感器的设计空间后，已有研究采用机器学习算法以较高准确度预测未表征序列的功能47。本方案中所述方法可轻松应用于新型语言学习模型在启动子设计中的测试，类似于基于跨核糖体结合位点（RBS）序列预测所开发的模型48。此外，整合此类模型可充分利用非功能性启动子设计中所包含的序列-功能数据，从而对生物传感器整体的更广泛功能提供关键见解。具体而言，这种方法有望解决DoE工作流程中的一个关键局限性：假阳性结果（例如非功能性启动子）并不一定等同于零测量输出，诸如随机转录等现象可能向DoE数据中引入噪声，而此类干扰难以识别和校正。至关重要的是，为了涵盖完整的实验设计空间，所构建的文库必须表现出广泛的功能活性；若活性范围不足，则会导致设计输出偏差，并降低基于该数据集生成的统计模型的可靠性30。若文库变异性过低成为问题，可尝试探索其他序列元件或提高随机化程度，并比较不同文库间的变异情况，直至获得合适的变体库。
实验设计（DoE）过程中的一个关键环节是正确估计和选择从DSD中获得的主效应与次级效应，并将其纳入统计分析。由于DoE是一种基于建模的方法，因此极易出现过拟合和偏差问题，这可能会通过引导迭代工程工作进入设计空间中的次优区域，从而迅速使优化过程复杂化49。因此，必须确保在实验设计构思阶段和数据分析阶段，所有设计方案均能有效避免此类影响。在初始筛选设计阶段，设置所有因素均处于几何平均值（即0,0,0,0）的中心运行点，有助于更准确地反映非线性交互作用，从而降低模型偏差，同时不会显著增加实验负担（仅需额外增加1–3次运行）49。此外，引入随机化设计有助于控制那些未被纳入实验设计但可能影响所测响应变量的外部变量。在生物学背景下，随机化可解决诸如空间-时间效应（如微孔板位置）或批次间变异等问题，防止这些因素显著干扰数据解读。在早期阶段关注这些细节，可提高模型的稳健性，并得出更可靠的结论。在完成DSD建议的实验后，需对数据进行统计分析，以明确对输出参数具有显著影响的因素。半正态图能够直观地展示效应大小：无显著性的效应通常落在一条直线上，而具有显著影响的效应则会偏离该直线，从而便于简单识别在生物传感器优化中最重要的因素。鉴于此，应采取保守的效应筛选策略，如同所有建模过程一样，以降低模型过拟合的风险。
快速设计和优化生物传感器及其他基因线路的能力将极大加快生物技术领域的研究进程，例如在菌株和酶的开发以及实时诊断方面。基于实验设计（DoE）的筛选方法在该领域中展现出特别广阔的前景，其能够在探索最大可能设计空间的同时，高效利用时间和资源，且已被成功应用于代谢通路和生物传感器基因线路的优化31,33,34,51。DoE尤其适用于多因素优化问题，其中存在大量一阶、二阶甚至三阶交互作用，而这些交互作用若采用传统的“一次改变一个因素”实验设计方法则难以被有效识别。此外，在对生物传感器某一特性进行工程化改造时，常常会无意中牺牲其他参数，例如在提高灵敏度的同时损失动态范围51。借助DoE识别此类隐藏交互作用的能力，以及构建可预测生物传感器行为的模型，显著加速了“构建-测试-学习”的循环过程。

调控基因表达的能力是所有生命形式中的一项基本功能，可实现对内部和外部影响因素（从化学效应物到生物物理刺激）的动态、实时响应1。自然界中存在的大量转录调控系统，在合成生物学推动的代谢工程和生物技术研究的增强与加速方面具有巨大潜力。在原核生物中，细胞内的大部分调控是通过单组分调控机制实现的，该机制由变构转录因子（aTFs）与多种小分子效应物相互作用所驱动2。aTFs通常包含一个效应物结合域（EBD）和一个DNA结合域（DBD），当其与特定的小分子效应物结合时，会作为分子开关发挥作用，改变其DBD对基因组启动子区域中特定DNA操纵序列的亲和力，从而导致转录的激活或抑制3。这一看似简单的机制衍生出了多种多样的调控策略，从抑制/去抑制系统到能够检测并响应大量小分子效应物或环境刺激的激活因子，种类繁多4。因此，合成生物学利用这种多样性构建了可遗传编码的生物传感器，能够将多种输入信号耦合为定制化的输出，例如荧光报告蛋白的产生以及对合成通路的调控。在生物技术工作流程中应用此类系统，可实现对细胞内代谢物浓度的实时监测、通路的动态调控，以及提供简便的读出方式，有助于开发更高效的代谢通路、菌株和生物工艺过程5,6,7,8。
从根本上讲，生物传感器的特性可通过多个参数来表征，包括特异性、工作范围、动态范围、灵敏度和斜率，其中生物传感器的剂量-响应曲线通过输出信号随配体浓度变化的关系来描述这些参数(图1)9,10,11,12。希尔方程可用于拟合生物传感器的性能特征，为上述各项参数提供半经验性依据，从而在表征生物传感器系统的同时，也为评估实现应用导向目标所需的系统优化工作提供支持。特异性可定义为一种效应分子所诱导的信号输出相对于其他一系列潜在效应分子所诱导信号输出的相对差异，通常在aTF的效应物结合结构域（EBD）水平上进行调控。工作范围是指生物传感器能够感知的配体浓度区间，决定了该传感器可响应的浓度范围。相比之下，动态范围描述的是最高可测激活状态（ON）与非激活状态（OFF）之间的比值，是确保生物传感器能够可靠报告高于背景自发荧光水平的效应物浓度的重要参数10。效应分子的灵敏度则以引发特定输出信号所需的浓度来表示，通常用效应物的半最大有效浓度（EC50）进行测量13。最后，曲线的斜率由aTF在其启动子区操作子位点上的协同性（nH）决定，从而导致更接近数字式或模拟式的响应输出特征。协同性的产生源于配体结合后的aTF之间发生蛋白质-蛋白质相互作用，形成多聚体复合物，增强其对操作子位点的亲和力，进而在配体浓度达到饱和时引起电路响应性的急剧上升，呈现出更趋数字化的响应特征14。
生物传感器的剂量响应特性会显著影响其应用的适用性，通常是决定任何概念性应用能否成功的关键因素。不同系统的生物传感器性能差异巨大，其工作范围通常在 0.1 nM–10 mM 之间。13，而动态范围可达1.4至2000倍15此外，尽管已报道的aTF效应化合物种类广泛（代谢产物、氨基酸、金属、抗生素、群体感应等）11然而，现有生物传感器并非无所不包，当文献中尚未存在适用于特定效应分子的生物传感器时，便给研究人员带来挑战。合成生物学的发展使得生物传感器的理性设计成为可能，从而能够调节效应分子的作用范围及其剂量-响应特性，使之更贴近具体应用的研究目标，并已分别被用于解决上述两方面的问题。16,17. 工程学的两个关键领域是可靶向的 通过 合成生物学，生物传感器的启动子区域以及人工转录因子（aTF）本身，在转录和蛋白质水平上介导其作用效果。本研究方法重点关注通过改造生物传感器的遗传元件以调节启动子水平性能的策略，包括对核糖体结合位点（RBS）、操纵位点以及-35和-10区（六碱基盒）的工程化改造，从而优化灵敏度、工作范围和动态范围。图1或者，通过分析生物传感器的效应物结合域，并对参与效应物协调的残基进行突变（利用序列同源性或/和结构生物学方法），可调节其对相应效应物的响应，从而改变该生物传感器的选择性和灵敏度18,19,20 或将其完全转变为一种非同源的效应分子16,17,21此类优化工作可引导生物传感器面向特定应用，这些应用通常包括代谢调控器（反馈回路、控制电路）、初筛工具（酶或菌株发现）、次筛工具（酶变体筛选、代谢工程）以及转运蛋白生物挖掘。22,23,24一个例子是利用对粘康酸响应的转录因子CatM，并结合人工设计的启动子序列，以提升系统的动态响应范围和操作范围。该系统与荧光激活细胞分选技术联用，在实验室适应性进化后，根据GFP荧光强度筛选出粘康酸产量最高的菌株。25.
尽管上述工程策略的成功显而易见，但合成生物学家可用于调节生物传感器的调控元件之间存在的相互依赖性，可能使设计过程复杂化，并延长生物传感器的开发周期，这可能会使部分研究人员不愿将其引入自身的工作流程中。如图1所示，试图通过修改六碱基盒（hexboxes）来调节生物传感器以实现特定目标时，可能会无意中削弱其他参数，这种相互依赖性是生物传感器工程中公认的一项挑战12。常见的生物传感器调节方法包括理性设计和定向进化工程：前者依赖于对系统结构和机制特征的先验知识（a priori understanding），将实验聚焦于成功概率较高的组分；而后者则依赖于随机诱变与自然进化，并结合高通量筛选，以挑选出具有优化特性的变异体26,27,28,29,30。尽管这些方法有效，但两者均存在某些局限性：例如，靶向工程因其专注于特定的结构或功能元件，往往对整个实验空间的探索有限，可能忽略别构效应或次要影响30。非靶向文库构建与筛选虽然在无需前期大量设计工作（即文库设计与构建）的情况下，适合以无引导方式优化设计，但仍需倾向于产生有益突变。若缺乏此类偏向性，则预计会有更大比例的突变是有害的，从而需要更多的筛选工作31。因此，能够综合考虑生物传感器各组成部分（如aTF、RBS、操纵位点和六碱基盒）的直接效应，以及这些组分之间如何相互作用以影响生物传感器参数的整体性策略，极具吸引力。
结构化多变量实验与统计建模方法已被广泛应用于过程工程工作流程中，旨在通过尽可能少的实验次数来探索多维实验空间。这种结合实验与建模的方法称为实验设计（Design of Experiments, DoE），其关键优势在于使研究人员能够在无需进行大量实验的前提下，针对预设目标优化复杂的多变量过程。 先验的 知识23,30尽管实验设计（DoE）通常用于优化连续变量，因其在结构化实验探索中更为便捷，但也已被应用于遗传水平上代谢途径的优化31,32,33这包括一个初步筛选步骤，其中选择被认为对期望结果最重要的因素，随后进行优化步骤，调整所选因素以获得期望的输出，在本例中即优化特定的生物传感器参数，以扩大其应用范围。关键的是，该技术可与自动化液体处理平台联用，将筛选通量提高至可处理中等规模的103 - 104 基于数据驱动的方法对生物传感器性能进行全局优化23下文介绍了一种基于实验设计（DoE）驱动的生物传感器优化方法，结合液体处理机器人技术，以简化文库构建、筛选及数据采集流程，实现对生物传感器灵敏度的全局优化。

<table><tbody><tr><td>1000 &amp;micro;L CO-RE 吸头，无菌无滤芯</td><td>Hamilton&amp;nbsp;</td><td>235939</td><td></td></tr><tr><td>2.2 mL 96 孔深孔板，方形孔，V 形底部</td><td>Thermo</td><td>11594754</td><td></td></tr><tr><td>300 &amp;micro;L CO-RE 吸头，堆叠式 NTR，无菌</td><td>Hamilton&amp;nbsp;</td><td>235985</td><td></td></tr><tr><td>96 孔透明底黑色微孔板</td><td>Greiner&amp;nbsp;</td><td>655097</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>16500100</td><td></td></tr><tr><td>已构建质粒 DNA</td><td>用户自备&amp;nbsp;</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>ClarioStar Plus 微孔板读数仪&amp;nbsp;</td><td>BMG</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>脱氧核苷酸（dNTP）溶液混合物&amp;nbsp;</td><td>NEB</td><td>N0447L</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）&amp;nbsp;</td><td>Fisher BioReagents&amp;nbsp;</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>DNA Ladder 100 bp</td><td>NEB</td><td>N3231L</td><td></td></tr><tr><td>DNA Ladder 1 KB</td><td>NEB</td><td>N3232L</td><td></td></tr><tr><td>DNA 测序&amp;nbsp;</td><td>Source Bioscience</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>DNA 合成&amp;nbsp;</td><td>IDT</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Escherichia coli &lt;/em&gt;DH5&amp;alpha; 感受态细胞</td><td>NEB</td><td>C2987H</td><td></td></tr><tr><td>凝胶上样染料，紫色 X6，不含 SDS</td><td>NEB</td><td>B7025S</td><td></td></tr><tr><td>基因脉冲仪/微脉冲电穿孔比色皿，0.2 cm 间隙</td><td>Bio-Rad&amp;nbsp;</td><td>1652082</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 10&amp;nbsp;</td><td>GraphPad</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton Star 液体处理系统&amp;nbsp;</td><td>Hamilton&amp;nbsp;</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>HT multitron 平板摇床培养箱&amp;nbsp;</td><td>Infors HT</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>JMP 统计分析软件套件&amp;nbsp;</td><td>JMP</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>LB 肉汤（Miller）</td><td>Miller&amp;nbsp;</td><td>L3522</td><td></td></tr><tr><td>含琼脂的 LB 肉汤（Miller）&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>L3147</td><td></td></tr><tr><td>MicroPulser 电穿孔仪&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad&amp;nbsp;</td><td>1652100</td><td></td></tr><tr><td>NEBuilder HiFi DNA 组装预混液</td><td>NEB</td><td>E2621S</td><td></td></tr><tr><td>Q5 高保真 DNA 聚合酶</td><td>NEB</td><td>M0491S</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin 中量提取试剂盒</td><td>QIAGEN</td><td>&amp;nbsp; 12143</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin 小量提取试剂盒</td><td>QIAGEN</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick 凝胶回收试剂盒&amp;nbsp;</td><td>QIAGEN</td><td>28706X4</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR 纯化试剂盒&amp;nbsp;</td><td>QIAGEN</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Qpix 420 菌落挑选仪</td><td>Molecular Devices UK</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>SOC 扩增培养基&amp;nbsp;</td><td>NEB</td><td>B9020S</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA 凝胶染料</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>TAE 缓冲液（Tris-乙酸-EDTA，50X）&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher&amp;nbsp;</td><td>B49</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt; 无 DNase/RNase 蒸馏水&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>10977015</td><td></td></tr></tbody></table>

利用实验设计与自动化工作流程实现基因编码生物传感器设计空间的高效采样

Efficient Sampling of Genetically Encoded Biosensor Design Space Enabled with a Design of Experiments and Automation Workflow

基因编码的生物传感器是用于高通量信息处理的强大工具，能够将环境或化学输入信号转化为多种输出信号。这使得在广泛的生物技术应用中实现基因表达的动态感知、直接控制和精细调控成为可能，包括酶的优化、菌株开发以及微生物过程控制。为了使其适应特定用途，可通过调整生物传感器回路组分的化学计量比（例如转运蛋白、输入模块和输出模块），和/或调节相关的宿主-生物传感器分子间相互作用（例如DNA-蛋白质、蛋白质-蛋白质相互作用）来优化生物传感器的性能。然而，此处可能存在的大量生物传感器组合形成了复杂的组合设计空间，因此需要仔细优化筛选策略，以鉴定出能够实现期望表型性能的配置。这种复杂性还因生物传感器的性能特征（例如可调性）而进一步加剧，这些特征需要在单克隆筛选条件下进行效应物滴定分析。因此，探索多样化序列和实验空间的需求使得部分采样方法特别适用于此目的。支撑该工作流程的是实验设计（Design of Experiment, DoE）算法，这类算法能够高效地基于统计学方法对这一组合式实验设计空间进行结构化映射和部分采样。
本文报道了一种结合高通量自动化与计算方法的综合策略，可高效采样基于变构转录因子的生物传感器的设计空间，从而获得具有数字式和模拟式剂量响应曲线的不同构型。该实验方案首先构建启动子和核糖体结合位点文库，并通过自动化手段进行筛选。这些文库及其相应的表达数据被转化为结构化的无量纲输入，从而实现对整个实验设计空间的计算映射。随后采用实验设计（DoE）算法进行部分采样，并结合高通量自动化平台进行效应物滴定分析。该工作流程为未来生物传感器系统和基因线路的开发与优化提供了一个通用框架，为合成生物学领域提供了一套调控工具包。

本方案提供了一种通过自动化辅助的基因文库构建与评估，对基因编码的生物传感器进行系统性全局优化的方法。该方法结合实验设计（design-of-experiment）策略，以简化实验流程，并实现对基因元件的选择，从而将生物传感器调节至特定的设计目标。

基因编码的生物传感器是用于高通量信息处理的强大工具，能够将环境或化学输入信号转化为可检测的输出信号。

我们的研究重点是面向生物技术应用的生物传感器的开发与优化。具体而言，我们旨在通过调控生物传感器的遗传元件，来理解如何对其进行优化与设计。基于经验直觉的设计方法，例如经典的启动子工程和荧光激活细胞分选，是生物传感器表征与设计中常规应用的技术。实验设计方法尚未在基因回路设计中得到广泛应用。通过本方案，我们旨在提高这些技术在基因回路和生物传感器设计中的采用率。首先，确定理论文库规模，并计算为确保超过95%文库覆盖率所需构建的独立变体数量。根据需要筛选的菌落数量，计算所需含抗生素的溶菌肉汤培养基的体积。打开液体处理仪软件，点击MTP液体转移程序旁边的运行。将准备好的培养基放入相应的储液槽位置。然后根据布局用空的微孔板填满板架。将程序设置为分配 200 µL 培养基。单击“确定”以确认程序开始。现在，将已加样微孔板的孔转移至菌落挑取仪平台，并打开密封后，将含有质粒变异文库DNA转化的恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）的方形螺旋板转移至菌落挑取仪平台中。使用菌落挑取仪从转化子平板上挑取单个菌落，接种至各预加样孔中。重新密封接种后的微孔板，并将其转移至离线振荡培养箱中。孵育结束后，将培养好的平板放回液体处理仪平台并打开密封。点击“向MTP中添加甘油”程序旁边的运行按钮。确保屏幕上显示的平板布局与液体处理仪对接端口的布局一致。然后依次点击“确定”以运行程序。程序结束后，密封培养板，并在离线摇床培养箱中以每分钟800转的速度短暂混匀5分钟。对培养板进行条形码标记，并于-80摄氏度保存，直至后续使用。计算深孔板所需的含抗生素培养基体积。点击深孔板液体转移程序旁边的运行按钮。确保将培养基加入正确的储液槽中。确保空的深孔板已放置在正确的布局位置，并且吸头供应充足。将程序设置为分配 495 µL 培养基。准备就绪后，依次点击“确定”以启动程序。现在，用透气膜密封已加样的深孔板，并转移至4°C条件下临时保存。接下来，点击“从解冻的MTP程序接种”旁边的运行按钮。确保按照布局将MTP冷冻保存液和已填充的深孔板转移至平台，并装载足量的吸头。依次点击“确定”以开始初始化。程序完成后，使用透气膜密封已接种的过夜深孔板模块，并将其转移至离线平板摇床培养箱中，在30摄氏度、800转/分钟、75%湿度条件下培养16小时。重新密封，混匀，并将冷冻保存用微量滴定板放回-80摄氏度冰箱。接下来，计算用于过夜培养待筛选深孔板所需的、添加了不同效应物和抗生素浓度的培养基体积。点击深孔板液体转移程序旁边的“运行”按钮。然后确保已正确放置添加了效应物的培养基储液槽。将空的深孔板放入液体处理平台中。当有足够数量的吸头可用时，依次点击“确定”以启动程序，生成用于检测的深孔板。加样完成后，使用透气膜密封检测用深孔板。将空板重新装入液体处理仪，重复接种操作，直至所有检测用孔板均被填满。接下来，点击“转移至检测用深孔板程序”旁边的运行。在将添加效应物的培养基的检测用深孔板正确放置并去封后，按照布局依次转移并打开含有培养过的恶臭假单胞菌（P. putida）的过夜深孔板。随后依次点击确定以启动程序。程序结束后，将转移测定板密封并放入离体培养箱中。接种后丢弃过夜培养的深孔块。接下来，将深孔块放入离心机中。在18摄氏度下，以4,000 G的离心力在预冷的转子中离心5分钟，沉淀细胞。弃去上清液后，将深孔板放置于液体处理平台。根据待筛选的深孔板数量，计算所需一倍浓度磷酸盐缓冲液（PBS）的体积。点击运行邻近检测设置 PBS 重悬 DWB 程序旁边的“运行”按钮，并将分配体积设为 500 微升。然后确保将 PBS 加入正确的储液槽中，并根据布局排列离心后的板。确认吸头可用后，点击“确定”以启动程序。重新密封并从液体处理仪中取出重悬的深孔板。检查板的底部，确保沉淀物已完全重悬。点击检测设置细胞旁的运行按钮，以及PBS版本MTP程序。然后根据布局将重悬的深孔板转移至液体处理仪中。根据布局加载空的微孔板，并在点击确定前将分配体积设置为 200 µL。将加样后的微孔板转移至离线多功能酶标仪，测定相对荧光强度和 OD600。对5,000个启动子变异体进行自动化筛选，鉴定出激活水平超过3.6倍的最佳候选序列。绘制100个独特变异体的EC50值，以可视化其敏感性分布并识别出性能稳定的候选序列。对226个富集的变异体计算EC50值，并通过Lin-log转换进行排序，构建具有敏感性梯度的文库。采用四个模块的 1、0 和 1 水平方差构建了明确的筛选设计方案。转运、调控因子、P-out 和输出核糖体结合位点模型的谱图揭示了这四个模块表达水平的变化如何非线性地影响 EC 50 和希尔系数。通过 RBS-Out 鉴定出最优表达组合，对灵敏度和斜率均表现出显著的正向作用。通过整合理想模块强度的全球优化生物传感器变体，相较于亲本型和DSD优化型，表现出更高的灵敏度和Hill系数。

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本方案介绍了一种用于工业微生物的标准高通量筛选流程。该流程包括通过ARTP诱变构建突变体文库，利用自动化微流控技术进行正向液滴筛选，随后对筛选结果进行验证。该工作流程的可靠性已通过筛选高产B.

高通量筛选L-乳酸高产菌株 Bacillus coagulans 利用自动化液滴微流控平台筛选突变体

了解基因编码生物传感器的自动化优化方法，通过实验设计和自动化筛选技术识别高灵敏度候选变体。该方法整合自动化文库生成与评估流程，显著提升遗传电路设计效率。

利用实验设计与自动化工作流程实现基因编码生物传感器设计空间的高效采样

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