Name: 通过基于输卵管核酸递送的体内电穿孔技术改进基因组编辑，用于基因敲除小鼠生成 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: 了解通过输卵管核酸递送进行体内电穿孔的I-GONAD方法，利用CRISPR/Cas9技术简化基因敲除小鼠的生成过程。该方法可减少实验动物使用数量，提高基因组编辑效率。

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作者感谢圣彼得堡大学研究园分子与细胞技术中心。测序工作在圣彼得堡国立大学科学园分子与细胞技术资源中心使用 ABI 3500 xL 遗传分析仪（Thermo Fisher Scientific，美国）完成。作者感谢 Maria Rubel 在文件编辑和提交过程中提供的帮助。本研究由圣彼得堡国立大学科研项目（项目编号：129658320）资助，Luibov Shkodenko 得到俄罗斯科学基金会（项目编号 25-26-00247）的支持。

所有动物实验均经圣彼得堡国立大学动物研究伦理委员会批准（批准号：131-03-5，2022年10月11日）。所有实验操作严格遵循《实验动物护理与使用指南》中规定的指导原则。实验所用常见的CD1远交系小鼠购自俄罗斯科学院生理活性化合物研究所集体使用中心（IPAC RAS）。用于交配的雌性CD1小鼠年龄为2-3个月（平均体重27-30 g），与年龄为2.5-4个月的雄性CD1小鼠（平均体重35-37 g）进行配对。本研究中使用的试剂和设备列于材料表中。
1. 单导向RNA（sgRNA）的设计及其转染前准备
<ol>
	<li>使用 CHOPCHOP、SYNTHEGO Knockout Guide Design 或 CRISPOR 等计算分析工具，识别靶向目标基因的潜在 sgRNA 序列。 
	注意：该软件可在整个基因范围内识别潜在的 sgRNA 序列，并在输出中提供多个变体选项。这些工具将推荐最优的 sgRNA 选项，并允许用户根据需要在所有已识别的变体中进行选择。在进行选择时，请考虑以下标准：
	<ol>
		<li>外显子邻近性：选择位于尽可能靠近目标突变位点的外显子中的序列。为获得更佳结果，应考虑可变剪接异构体，选择存在于最多异构体中的靶序列。可借助基因组浏览器（如 Ensembl）进行准确的外显子选择。</li>
		<li>脱靶效应考量：利用工具的评分系统分析潜在的脱靶效应，优先选择预测脱靶活性最低的序列。 
		注意：CHOPCHOP 或 Synthego 等计算工具在评估外显子邻近性和脱靶效应方面非常有效，有助于识别用于精确基因组编辑的最优 sgRNA 序列。在设计向导 RNA 时，需考虑所用小鼠品系中目标基因的特定序列。对于某些小鼠品系（如 C57Bl、CBA、C3H），已有完整的基因组序列数据。若缺乏此类数据，建议对计划编辑区域的目标基因进行初步测序。由多态性引起的向导 RNA 中的单个错配可能会影响编辑效率。ROSA 26 小鼠基因组位点的 sgRNA 靶向序列为：5'-ACTCCAGTCTTTCTAGAAGA-3'。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照表 1所述订购用于 sgRNA 模板 PCR 扩增的一组引物。 
	注意：gRNA 也可从其他来源订购，形式可为 sgRNA 或 crRNA:tracrRNA 双链体。</li>
	<li>制备线性 dsDNA 模板。
	<ol>
		<li>按照表 1所示配制主混合液。最后加入聚合酶，并将主混合液置于冰上以保持其稳定性。</li>
		<li>在以下条件下运行 PCR：初始变性：95 °C 下 30 秒；30 个循环：95 °C 下 20 秒（变性），55 °C 下 20 秒（退火），72 °C 下 15 秒（延伸）；最终延伸：72 °C 下 2 分钟；4 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将 PCR 反应混合物用于后续的体外转录（IVT）反应。
	<ol>
		<li>按照表 2所示配制 IVT 主混合液，在 37 °C 下孵育 1.5 小时。使用热循环仪以确保温度控制的一致性。</li>
		<li>加入 2 µL DNase I，在 37 °C 下再孵育 30 分钟，以去除 DNA 模板。</li>
		<li>将反应混合物在 75 °C 下孵育 5 分钟，使 DNase I 失活。</li>
		<li>按照制造商的说明，使用 TRIZOL 试剂纯化 RNA。 
		注意：TRIZOL 试剂、DNase I 及其溶液或任何副产物的废弃物应放入指定的化学废物容器中。</li>
		<li>使用分光光度计测定 RNA 浓度（单次反应的典型产量为 3–5 µg）。检测 A260/A280 和 A260/A230 比值。A260/A280 应至少为 2.0，A260/A230 比值也应至少为 2.0（表明无蛋白质或有机溶剂污染）。将 sgRNA 储存于 -80 °C 直至使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备用于转染的 RNP 混合物
	<ol>
		<li>转染混合物由 RNP 复合物组成，即 Cas9 蛋白与 sgRNA 的混合物。按照以下步骤制备 RNP 混合物：</li>
		<li>使用无核酸酶水将 1 M Tris-HCl（pH 7.5）缓冲液稀释至 100 mM，并使用孔径为 0.022 µM 的注射器滤器过滤，分装为每份 10 µL，4 °C 储存直至使用。</li>
		<li>在无核酸酶的离心管中，按以下终浓度配制转染混合物：500 ng/µL spCas9 核酸酶，80 ng/µL sgRNA，10 mM Tris-HCl 用 DEPC 处理水稀释。 
		注意：RNP 混合物组分的高浓度对于确保实验方案的效率至关重要。</li>
		<li>将转染混合物在 37 °C 下孵育 10 分钟，以促进 RNP 复合物的形成。</li>
		<li>将混合物分装为适合单次 I-GONAD 实验的小体积（2 µL）。</li>
		<li>I-GONAD 实验期间将分装样品保存在 4 °C。每次 I-GONAD 电穿孔实验均需新鲜配制混合物以保持其稳定性。 
		注意：每次 I-GONAD 实验均应新鲜配制 RNP 混合物，以确保最佳活性和效率。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 基因组编辑用雌性小鼠的准备 通过 输卵管核酸递送
<ol>
	<li>小鼠交配与雌鼠筛选：将CD1雌鼠与单笼饲养的CD1雄鼠过夜交配。次日早晨检查雌鼠是否存在交配栓。选取带有交配栓的雌鼠，转移至新笼中以进行后续操作。 
	注意：为尽量减少遗传嵌合现象，最佳的基因构建体递送时间为交配后0.7天，即单细胞（受精卵）阶段10。该时间点大致相当于发现交配栓当天的下午16:00。在此阶段，解剖输卵管可见受精卵周围的卵丘细胞较少，但仍位于壶腹部。值得注意的是，在电穿孔过程中，卵丘细胞也可能摄取外源核酸或蛋白质。若操作时间过早（例如交配后10小时），卵丘细胞仍紧密包裹受精卵，可能阻碍核酸通过电泳高效递送至受精卵内。请勿使用激素刺激的雌鼠，因其可能产生过多卵母细胞，进而导致流产。</li>
	<li>手术器械准备：将所有不锈钢手术器械进行高压灭菌，以确保无菌。所有与小鼠内脏器官接触的非不锈钢物品应提供为无菌或一次性使用物品。</li>
	<li>镇痛、麻醉及小鼠准备：称量选定的雌鼠体重，并在诱导麻醉前15分钟皮下注射美洛昔康溶液（5 mg/kg）。通过腹腔注射给予氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）混合物对小鼠进行麻醉（遵循机构批准的操作规程）。
	<ol>
		<li>监测小鼠趾夹反射是否消失，以确认麻醉效果充分。将麻醉后的小鼠置于加热垫上，以维持术中体温。使用兽用眼膏保护小鼠眼睛，防止麻醉期间角膜干燥。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 手术步骤
<ol>
	<li>去除手术区域的毛发，并使用氯己定或聚维酮碘溶液或洗剂进行皮肤消毒，随后用70%乙醇重复交替擦拭三次。</li>
	<li>在背部下部区域做一个0.7 cm的纵向皮肤切口。</li>
	<li>用剪刀尖端轻微张开并向侧方推挤，将切口延长至1.3 cm。</li>
	<li>小心地在腹膜上做一个小切口（0.7 cm），以进入腹腔。</li>
	<li>用剪刀尖端轻微张开并向侧方推挤，将切口延长至1.1 cm。</li>
	<li>找到与卵巢相连的脂肪垫，并用镊子轻轻将其拉出，直至卵巢、输卵管和子宫清晰可见。</li>
	<li>使用血管夹固定脂肪垫的位置。</li>
	<li>在体视显微镜下观察输卵管，以便进行精确操作（图1）。</li>
	<li>使用Stripper Pipettor将2 µL注射混合液吸入无菌塑料毛细管中。 
	注意：Stripper Pipettor配合无菌塑料毛细管最初设计用于辅助生殖诊所中的胚胎操作，但也可支持多种应用，包括胚胎移植以及I-GONAD操作中CRISPR/Cas9构建体的递送。该移液器可作为精密液体分配装置；结合一次性无菌柔性毛细管使用，可保证无菌性并防止交叉污染。在向输卵管转染RNP混合物时，塑料毛细管优于玻璃毛细管，因其对脆弱组织的损伤更小。与玻璃毛细管不同，一次性塑料毛细管无需在插入前通过火焰抛光来钝化锋利边缘，从而缩短准备时间并降低损坏风险。</li>
	<li>使用显微剪刀，在壶腹部上游数毫米处的输卵管壁上做一个小切口（0.2 cm）。</li>
	<li>小心将装有塑料毛细管的Stripper Pipettor插入切口，并将注射混合液注入输卵管。 
	注意：确保无空气进入输卵管，否则可能影响电穿孔效率。 
	为避免此问题，应使塑料毛细管中装载的注射液略多于所需量，并避免完全排空。塑料毛细管适用于漏斗部转移以及漏斗部与壶腹部之间输卵管壁的直接解剖。直接输卵管壁解剖法可能比漏斗部转移创伤更小，因为后者需先切开覆盖输卵管和漏斗部的薄层囊膜。在CD1小鼠中，该膜血管丰富，切割可能导致轻微出血，从而影响视野清晰度并增加RNP混合物显微注射的难度。</li>
	<li>轻柔地将塑料毛细管从输卵管中取出。</li>
</ol>
4. 电穿孔与缝合
<ol>
	<li>按下前面板上的开关，打开电穿孔仪。</li>
	<li>设置电穿孔参数：打孔脉冲：电压：50 V，脉冲时长：5 ms，脉冲间隔：50 ms，脉冲次数：3，衰减率：10%，极性：+/-；转移脉冲：电压：10 V，脉冲时长：50 ms，脉冲间隔：50 ms，脉冲次数：3，衰减率：40%，极性：+/-；电流限制：in vivo。</li>
	<li>使用镊子型电极小心夹住输卵管，通过按下电穿孔仪上的 kΩ 按钮检测电阻值。确保电极充分压紧，使电阻保持在 350–400 Ω 的最佳范围内。 
	注意：当完整的输卵管被夹在两个电极之间时，可通过调节两电极之间的距离实现该目标。
	<ol>
		<li>测量电阻后立即按下“开始”按钮以启动电穿孔。此步骤至关重要，可确保将 CRISPR-Cas 组分高效递送至受精卵4。等待 Ω 按钮显示 &#34;end&#34; 信号。记录“测量”框中显示的数值。 
		注意：阻抗值应约为 250–400 Ω，对应电流为 150–250 mA，以确保细胞存活率与转染效率之间的最佳平衡。为维持此平衡，应避免按照某些方案推荐的做法，用浸有杜氏改良磷酸盐缓冲液（DPBS）的湿纸覆盖输卵管区域，因为该操作会显著降低电阻，超出最佳范围。电阻降低可能导致电流升至 250 mA 以上，从而引起细胞死亡。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>完成一侧输卵管的电穿孔后，小心将生殖道放回腹腔内，并使用 4-0 聚乙醇酸外科缝线缝合切口。</li>
	<li>对另一侧输卵管重复相同操作和电穿孔。完成后，将生殖道复位至腹腔内，并按上述方法缝合切口。</li>
	<li>术后监测：将小鼠置于温暖（37 °C）、清洁的笼中恢复，并持续观察直至其完全从麻醉中苏醒。 
	注意：术后将小鼠以每笼两只的方式饲养。若仅有一只小鼠接受手术，应为其提供一只同伴雌鼠。该做法有助于减少手术小鼠的不必要应激，促进更自然的社交环境。术后 12 小时，进行第二次镇痛药注射（美洛昔康，5 mg/kg，皮下注射）。</li>
</ol>
5. 基因分型
<ol>
	<li>引物设计
	<ol>
		<li>用于基因分型时，设计引物以扩增长度在 300–600 bp 之间的 PCR 产物。引物长度应为 18–21 个核苷酸，熔解温度（Tm）约为 60 °C。</li>
		<li>避免形成二级结构或引物二聚体的序列。使用 PerlPrimer 1.1.2111、In-Silico PCR V39x1 或类似软件工具确保引物质量。</li>
		<li>对小鼠基因组数据库进行 BLAST 搜索，以确认引物特异性并避免非特异性扩增11。 
		注：以下引物用于目标序列的基因分型：正向引物：5'-CTCTCCCAAAGTCGCTCTGA-3'；反向引物：5'-TCTGTGGGAAGTCTTGTCCC-3'，预期 PCR 产物长度：320 bp，Tm 为 62°C。用于 Sanger 测序时，设计一个距离 Cas9 切割位点 150–200 bp 处退火的测序引物。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行 DNA 提取。对于快速 DNA 提取，Hotshot 分离法12 是最简单的方法。
	<ol>
		<li>使用耳孔钳从小鼠耳朵上采集一小块组织（约 2 mm）。</li>
		<li>加入 100 µL 裂解缓冲液（25 mM NaOH，0.2 mM EDTA，pH = 12）。</li>
		<li>在 95 °C 下孵育 60 分钟，每 20 分钟涡旋混合一次。</li>
		<li>加入 100 µL 中和缓冲液（40 mM Tris-HCl，pH = 5），充分涡旋混匀。</li>
		<li>取最终提取物 1–5 µL 用于 PCR 反应。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>PCR 扩增与测序。按照 表 3 所示配制 PCR 主混合液。使用具有校对功能的 DNA 聚合酶以确保高保真性。将主混合液分装至所需数量的试管中，并加入基因组 DNA。 
	注：测序分析时应始终包含野生型 DNA 样本作为对照。</li>
	<li>进行 ROSA26 基因分型的 PCR 扩增。使用以下条件：初始变性：95 °C 下 30 秒；28 个循环：95 °C 下 20 秒（变性），62 °C 下 20 秒（退火），72 °C 下 20 秒（延伸）；最终延伸：72 °C 下 2 分钟；4 °C 保存。 
	注：本方案适用于使用步骤 1.1.2 中的引物扩增 ROSA26 位点片段（预计大小为 320 bp）。为实现更特异和准确的扩增，建议将扩增循环数限制在 28–30 个循环。</li>
	<li>测序与分析
	<ol>
		<li>对获得的 PCR 片段进行 Sanger 测序（见步骤 5.4）。</li>
		<li>测序结果分析 
		注：成功转染将产生嵌合动物，可通过测序色谱图中核酸酶切割位点附近出现额外 DNA 序列来识别。使用 EditCo ICE Analysis 或 TIDE13 等计算工具识别并量化基因组中的确切插入缺失（indel）。
		<ol>
			<li>使用 ICE Analysis 时，只需上传获得的 Sanger 测序文件（野生型小鼠 PCR 产物无编辑的对照 .ab1 文件，以及实验小鼠 PCR 产物的实验 .ab1 文件），输入向导 RNA 序列，并选择 CRISPR 实验中使用的核酸酶。 
			注：ICE Analysis 工具将计算总体编辑效率，并确定样本中所有不同类型编辑的谱型及其相对丰度。</li>
			<li>使用 TIDE 时，输入向导 RNA 序列，上传获得的 Sanger 测序文件（野生型小鼠 PCR 产物无编辑的对照 .ab1 文件，以及实验小鼠 PCR 产物的实验 .ab1 文件），并检查参数设置（在某些情况下，高级设置有助于检测大于 10 bp 的插入缺失）。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

使用I-GONAD方法制备基因敲除小鼠的效率与传统的显微注射技术相当。然而，传统方法需要从供体雌鼠中分离受精卵，进行显微注射，并将胚胎移植到假孕雌鼠的输卵管中。相比之下，I-GONAD方法通过将基因编辑组分直接递送至妊娠雌鼠的输卵管内，简化了该流程，从而无需进行受精卵的分离和胚胎移植。本方案通过利用CRISPR/Cas9技术在小鼠6号染色体上的ROSA26位点成功引入突变，展示了I-GONAD方法的有效性。通过对该技术的优化，I-GONAD操作中最关键的步骤包括：在电穿孔过程中设置合适的电阻和电压参数，以及确保在注射遗传构建物时无空气进入输卵管。
电阻值应约为 350-400 Ω，对应的电压为 100-200 mA，以确保细胞存活率与转染效率之间的最佳平衡。必须避免电阻降低，因为这可能导致电压超过 250 mA，从而引起受精卵死亡。
使用浸湿的滤纸（浸泡于杜氏改良磷酸盐缓冲液（DPBS）中）来夹取输卵管，这一步骤在其他方案中常有描述8,<s...

了解疾病的遗传基础对于揭示其病因和发病机制的分子过程至关重要。该研究的关键步骤是建立具有靶向基因敲除的动物模型，以模拟人类疾病。由于小鼠在基因组上与人类具有较高的相似性，且体型小、寿命短、繁殖力强，因此在这些研究中尤为有价值。小鼠模型在基础研究和临床前测试中均具有重要意义1。
利用CRISPR-Cas9系统构建基因敲除小鼠时，研究人员通常将向导RNA与Cas9核酸酶的复合物注射到受精卵中，从而在目标DNA序列上造成双链断裂，激活细胞的修复系统，进而在断裂位点引入突变1,2。显微注射至受精卵目前仍是该技术的金标准。然而，该方法包含多个步骤：从供体雌鼠中分离胚胎，对受精卵进行遗传构建体的显微注射，并通过手术将胚胎移植至假孕雌鼠的输卵管中。因此，需要维持大量动物，包括供体雌鼠、结扎雄鼠和假孕雌鼠。此外，受精卵的分离过程需要处死供体雌鼠。因此，遵循3R原则（替代、减少、优化）3，应优先采用可减少动物使用量的实验方案。
电穿孔技术的进步，例如使用Nepa21系统，为通过一种称为“经输卵管核酸递送的改进基因组编辑”（Improved Genome editing via Oviductal Nucleic Acids Delivery, I-GONAD）的技术在单步内生成靶向基因敲除小鼠提供了独特的机会4。Super Electroporator NEPA21 Type II采用四步多脉冲电穿孔系统，可在保持胚胎高存活率的同时实现高效的电穿孔。I-GONAD技术包括在小鼠受孕后0.7天，将CRISPR-Cas组分（Cas9蛋白（500–600 ng/µl）和向导RNA（80–100 ng/µl））微量注射至怀孕小鼠的输卵管内，随后进行体内电穿孔，将这些组分直接递送至受精卵中5。完成I-GONAD操作后，怀孕小鼠产下的仔鼠即携带靶向基因的敲除6,7,8。该方法的效率因靶标不同而有所差异，但总体与传统的显微注射技术相当（约50%）9,10。此外，I-GONAD技术未来还有望被改造用于其他物种的基因组编辑。
本文介绍了一种采用I-GONAD方法制备基因敲除小鼠的逐步实验方案。以小鼠6号染色体上的ROSA26基因位点为靶点，展示了该方法的有效性。选择该位点的原因在于其具有持续转录活性但不进行后续翻译。因此，在该位点引入突变对所获得仔鼠的健康产生不利影响的可能性较低。

<table><tbody><tr><td>0.5&amp;ndash;5 µL 移液器&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>4642020</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 离心管</td><td>Aptaca</td><td>1003/G</td><td></td></tr><tr><td>100-1000 µL 移液器&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>4642090</td><td></td></tr><tr><td>200 µL 管</td><td>Axygen</td><td>PCR-02-C</td><td></td></tr><tr><td>20-200 µL 移液器&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>4642080</td><td></td></tr><tr><td>2-20 µL 移液器&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>4642060</td><td></td></tr><tr><td>4× 凝胶上样染料</td><td>Biolabmix</td><td>D-3002</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>AppliChem</td><td>A8963,0500</td><td></td></tr><tr><td>DNase I，无 RNase（1 U/&amp;mu;L）</td><td>Thermo Fisher</td><td>EN0521</td><td></td></tr><tr><td>dNTP 混合物，100 mM 溶液</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0181</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq Green DNA 聚合酶（5 U/&amp;mu;L）</td><td>Thermo Scientific</td><td>EP0713</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s 改良磷酸盐缓冲液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>EditCo ICE 分析</td><td>https://ice.editco.bio/#/</td><td></td><td>2025年6月4日访问</td></tr><tr><td>EDTA 0.5 M 溶液，pH = 8</td><td>AppliChem</td><td>A4892,0500</td><td></td></tr><tr><td>Ensembl</td><td>&amp;nbsp;https://www.ensembl.org/index.html</td><td></td><td>2025年6月9日访问</td></tr><tr><td>溴化乙锭</td><td>Biolabmix</td><td>EtBr-10</td><td></td></tr><tr><td>眼用凝胶滴剂 &amp;ldquo;Oftagel&amp;rdquo;</td><td>URSAPHARM</td><td>204604</td><td></td></tr><tr><td>凝胶成像系统 ChemiDoc XRS+</td><td>Bio-Rad</td><td>1708265</td><td></td></tr><tr><td>计算机模拟 PCR V39x1&amp;nbsp;</td><td>https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr</td><td></td><td>&amp;nbsp;2025年6月9日访问</td></tr><tr><td>Integrated DNA Technologies&amp;nbsp;</td><td>https://eu.idtdna.com</td><td></td><td>2025年6月9日访问</td></tr><tr><td>显微外科剪刀</td><td>Medin URAL</td><td>M124</td><td></td></tr><tr><td>NEPA21 电穿孔仪</td><td>Nepa Gene</td><td>NEPA21</td><td>配备 CUY652P2.5X4 电极</td></tr><tr><td>NTP 混合物，100 mM 溶液</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0481</td><td></td></tr><tr><td>寡核苷酸</td><td>Evrogen</td><td></td><td>直接订购，标准脱盐纯化</td></tr><tr><td>Opti-MEM I 低血清培养基</td><td>Thermo Fisher</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>PerlPrimer</td><td>https://perlprimer.sourceforge.net</td><td></td><td>版本 1.1.21。</td></tr><tr><td>Phusion 高保真 DNA 聚合酶（2 U/&amp;mu;L）</td><td>Thermo Scientific</td><td>F530L</td><td></td></tr><tr><td>10 µL 移液器吸头</td><td>Ulplast</td><td>HT-10-960</td><td></td></tr><tr><td>1000 µL 移液器吸头</td><td>Ulplast</td><td>HT-1000-576</td><td></td></tr><tr><td>200 µL 移液器吸头</td><td>Ulplast</td><td>HT-200-960</td><td></td></tr><tr><td>电源 &amp;ldquo;Elf-4&amp;rdquo;</td><td>DNA-technology</td><td>PS-400 NEW</td><td></td></tr><tr><td>无 RNase/DNase 水</td><td>Invitrogen</td><td>10977049</td><td></td></tr><tr><td>生理盐水溶液</td><td>PanEco</td><td>P011n</td><td></td></tr><tr><td>SE-1 水平电泳系统</td><td>Helicon</td><td>SE-1</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881-500G</td><td></td></tr><tr><td>Step100 DNA Marker</td><td>Biolabmix</td><td>S-8100</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜 SMZ1000</td><td>Nikon</td><td>5-363376</td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头剥离器</td><td>CooperSurgical</td><td>MXL3-STR</td><td></td></tr><tr><td>剥离吸头</td><td>ORIGIO</td><td>MXL3-125</td><td></td></tr><tr><td>手术针&amp;nbsp;</td><td>KMIZ</td><td>4A1- 0.6&amp;times;20</td><td></td></tr><tr><td>持针钳</td><td>Medin URAL</td><td>M302.2</td><td></td></tr><tr><td>持针钳</td><td>Medin URAL</td><td>M303</td><td></td></tr><tr><td>缝合线 POLYCON N&lt;img alt=&quot;公式 1&quot; src=&quot;/files/ftp_upload/68704/68704eq1.jpg&quot; style=&quot;margin: auto;&quot;/&gt;0</td><td>Tonzos 95</td><td>234</td><td></td></tr><tr><td>SYNTHEGO 基因敲除向导设计&amp;nbsp;</td><td>https://design.synthego.com/#/</td><td></td><td>2025年6月9日访问</td></tr><tr><td>T100 扩增仪</td><td>BioRad</td><td>10014822</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA 聚合酶&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>EP0111</td><td></td></tr><tr><td>TBE 10× 缓冲液</td><td>Biolabmix</td><td>TBE-500</td><td></td></tr><tr><td>Tide&amp;nbsp;</td><td>https://tide.nki.nl/</td><td></td><td>2025年6月4日访问&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Tris 盐酸盐</td><td>Suzhou Yacoo Science</td><td>SYS-S0005-0.5</td><td></td></tr><tr><td>Trizma 盐酸盐溶液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T2663</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol 试剂</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>TrueCut Cas9 蛋白</td><td>Invitrogen</td><td>A36499</td><td></td></tr><tr><td>通用剪刀</td><td>Medin URAL</td><td>M147</td><td></td></tr><tr><td>赛拉嗪</td><td>Interchemie Werken de Adelaar</td><td>IX2</td><td></td></tr><tr><td> Zoletil</td><td>Virbac Lab</td><td>2000443714739.00</td><td></td></tr></tbody></table>

基因组编辑技术的改进 通过 基于输卵管核酸递送的 在体 内 电穿孔技术用于基因敲除小鼠的制备

Improved Genome Editing via Oviductal Nucleic Acids Delivery-based In Vivo Electroporation Technique for Knockout Mice Generation

创建基因敲除小鼠的方法通常包括三个主要步骤：（1）从供体雌性小鼠收集胚胎，（2）将遗传构建体显微注射至受精卵中 离体，以及（3）将它们手术移植到假孕雌性小鼠的输卵管中。该过程需要使用大量的实验动物，因为它不仅涉及供体雌性小鼠，还需要使用结扎输精管的雄性小鼠和假孕雌性小鼠。此外，对小鼠受精卵的细胞质或原核进行显微注射时，常面临针头堵塞、由于细胞膜弹性过高导致通透性困难，以及胚胎潜在死亡等挑战。先进电穿孔仪（如Nepa21）的发展为通过一种称为“改良基因组编辑”（Improved Genome Editing）的方法，在单一步骤中直接获得靶向基因敲除小鼠提供了独特的机会。 通过 输卵管核酸递送技术（I-GONAD）。该技术包括在受孕后0.7天将CRISPR-Cas组分（Cas9蛋白和引导RNA）显微注射至妊娠雌性动物的输卵管内，随后进行 体内 通过电穿孔将这些组分直接递送至受精卵中。按照I-GONAD操作流程，怀孕小鼠将产下携带目标基因敲除的仔鼠。本文提供了一套在小鼠中实施I-GONAD方法的详细分步实验方案，为传统基因敲除小鼠制备技术提供一种更高效且易于操作的替代方案。

如果电穿孔成功，实验小鼠将：（1）产下少量仔鼠，（2）部分个体基因组中出现不同的插入缺失（indels）。若基因分型引物设计合理且PCR程序优化得当，琼脂糖凝胶上将出现一条清晰、大小符合预期的PCR扩增条带。若核酸酶成功切割靶标DNA，则获得的动物很可能为嵌合体，并在基因组中携带多种类型的插入缺失。可使用计算工具（如EditCo ICE Analysis或TIDE）来确定基因组中确切的插入缺失类型。该分析所需的输入信息包括：sgRNA间隔序列、野生型对照小鼠PCR产物序列的色谱图文件，以及实验组小鼠PCR产物序列的色谱图文件。分析结果将生成一个图示，展示插入缺失变异的分布情况、对照组与实验组探针之间的差异程度，以及（若使用EditCo ICE Analysis）切割位点附近的序列比对结果（图2）。分析结果可能显示单个F0代小鼠体内存在多个突变等位基因。对于每个等位基因，程序将提供以下参数：插入缺失百分比、模型拟合度及基因敲除评分。
总的插入缺失百分比表示编辑效率，而每个单独等位基因的插入缺失百分比则反映该特定编辑结果出现的...

基因组编辑改进效率 通过 输卵管核酸递送（I-GONAD）方法与传统显微注射技术相当，后者需要从供体雌性动物中收集受精卵，并将其移植到假孕雌性动物体内。本方案通过引入CRISPR/Cas9诱导的突变，证明了该方法的有效性 ROSA26 6号染色体上的位点

创建基因敲除小鼠的方法通常包括三个主要步骤：（1）从供体雌性小鼠中收集胚胎，（2）显微注射遗传载体……

本研究的目的是通过在体子宫内电穿孔技术，将基因组编辑组分直接递送至怀孕雌性小鼠的输卵管，从而简化基因敲除小鼠的制备过程。传统的原核显微注射方法需要维持大量动物，包括供体雌鼠、受体雌鼠以及输精管结扎雄鼠。因此，能够减少动物使用数量的实验方案更具优势。使用 Nepa21 系统对受精卵进行电穿孔，可在单步操作中高效地生成靶向基因敲除小鼠，其效率可与传统的基于核显微注射的技术相媲美。首先，利用计算分析工具鉴定靶向目标基因的潜在单导向 RNA 序列。选择位于外显子中且尽可能靠近目标突变位点的序列。使用基因组浏览器比对外显子结构，并优先选择存在于大多数剪接异构体中的序列。使用该工具集成的评分系统分析每条向导序列的预测脱靶活性。选择脱靶结合可能性最低的序列。为生成线性双链DNA模板，根据下表中指定的组分配制PCR主混合液。最后加入聚合酶，并将主混合液置于冰上以保持酶的稳定性。然后，使用以下热循环条件进行PCR反应。接着，使用指定组分配制体外转录主混合液，并在37摄氏度下使用热循环仪孵育反应1.5小时，以确保温度控制的一致性。然后，向反应体系中加入 2 µL DNase I。在 37 °C 下额外孵育 30 分钟以消化 DNA 模板，随后在 75 °C 下孵育 5 分钟以灭活酶。经 TRIzol 法纯化 RNA 后，使用分光光度计测定 RNA 浓度，并检测 A260/A280 和 A260/A230 比值。为转染制备核糖核蛋白复合物时，使用无核酸酶水将一摩尔 Tris-HCl 缓冲液稀释至 100 毫摩尔浓度。用孔径为 0.022 微米的注射器滤器过滤溶液。分装成每份 10 微升，于 4 摄氏度保存，直至使用。接下来，在无核酸酶的离心管中，使用spCas9核酸酶、单链向导RNA和用DEPC水稀释的Tris-HCl配制转染混合物。将转染混合物在37摄氏度孵育10分钟，以促进核糖核蛋白复合物的形成。然后，将转染混合物分装成适合单次I-GONAD实验的小份体积，并置于4摄氏度保存，以维持试剂活性。将CD1雌性小鼠与单只饲养的CD1雄性小鼠过夜交配后，检查每只雌鼠是否存在交配栓。仅将观察到明显交配栓的雌鼠转移至新笼中，用于后续实验操作。使用前需对所有不锈钢手术器械进行高压灭菌，以确保无菌状态。然后，使用电子天平称量选定的插头=阳性雌性小鼠的体重，再进行麻醉。监测麻醉后小鼠是否失去脚趾夹捏反射，以确认麻醉效果充分。将小鼠置于加热垫上，以在操作过程中维持其体温。然后，在眼睛上涂抹兽用眼膏以防止干燥。使用精细剪刀，在下背部区域的皮肤上做一个0.7厘米长的纵向切口。接着，将剪刀的尖端略微张开并向两侧轻轻分离，以将皮肤切口轻柔地延长至约1.3厘米。随后，仔细在腹膜上做一个0.7厘米的切口，以暴露腹腔。将腹膜切口向两侧延伸至1.1厘米，用剪刀尖稍张开并轻轻向两侧推开。找到与卵巢相连的脂肪垫，用镊子轻轻将其向外牵拉，直至暴露卵巢、输卵管和子宫。使用血管夹固定脂肪垫，以稳定生殖结构。接下来，用移液枪将2 µL核糖核蛋白注射混合物吸入一次性塑料毛细管中。使用显微剪刀，在壶腹部上游几毫米处的输卵管壁上做一个0.2 cm的切口。将连接在剥离式移液器上的塑料毛细管插入输卵管切口，小心地推出注射混合液，避免引入空气。轻轻将塑料毛细管从输卵管中抽出，完成注射。按下前面板上的电源开关，启动电穿孔仪。根据屏幕上的提示设置电穿孔仪的参数。使用镊子型电极轻轻夹住输卵管，按下 Kiloohm 按钮以测量电阻。测量电阻后，立即按下 Start 按钮开始电穿孔，并等待 Ohm 按钮上出现结束信号。完成第一输卵管的电穿孔后，轻柔地将生殖道复位至腹腔内。使用4-0聚乙醇酸外科缝线关闭切口。进行基因型鉴定时，设计长度为18至21个核苷酸、熔解温度接近60摄氏度的引物，以扩增出300至600个碱基对的PCR产物。为确认每对引物的特异性，需针对小鼠基因组数据库进行BLAST比对，以排除非特异性扩增的风险。接下来，进行DNA提取：使用耳缘打孔法，从小鼠耳朵采集约两毫米大小的小块组织样本，加入100 µL裂解缓冲液。将样品在 95 摄氏度孵育 60 分钟，每 20 分钟涡旋振荡一次，以确保有效的裂解。完成 Sanger 测序后，分析结果以评估基因组编辑效果。进行 ICE 分析时，需上传 Sanger 测序文件，输入向导 RNA 序列，并选择 CRISPR 实验中使用的相应核酸酶。接下来，使用 TIDE 时，上传 AB1 格式的对照和实验测序文件，并输入向导 RNA 序列。ICE 分析在 Cas9 切割位点处检测到三种不同的插入缺失变异：42% 的序列中存在一个碱基对的缺失，25% 的序列中存在三个碱基对的缺失，27% 的序列中存在 23 个碱基对的缺失。模型拟合值为 0.94，敲除评分为 69，表明具有较强的预测相关性，且很可能实现基因敲除。测序色谱图证实，在经编辑的样本中，Cas9 切割位点处序列发生中断，而对照样本的色谱图在同一位置显示序列完整。在六只电穿孔处理的小鼠中，仅有四只产下携带突变的仔鼠，总体编辑效率为 60%。六只电穿孔小鼠的所有窝仔数均减少，每只小鼠仅产下 3 至 4 只仔鼠。

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Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

通过基于输卵管核酸递送的体内电穿孔技术改进基因组编辑，用于基因敲除小鼠生成

为了评估中脑多巴胺能神经元发育过程中基因的功能及其调控机制，我们描述了一种方法，该方法涉及将质粒DNA构建体进行卵内电穿孔转染至鸡胚中脑腹侧多巴胺能神经元前体细胞中。in ovo...

in ovo 鸡胚中脑电穿孔技术用于研究多巴胺能神经元发育中基因功能

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利用设计核酸酶进行小鼠基因组编辑

小鼠卵母细胞的显微注射通常用于经典的转基因技术（即外源基因的随机整合）以及CRISPR介导的基因靶向。本实验方案综述了显微注射技术的最新进展，特别强调质量控制和基因分型策略。...

通过卵母细胞显微注射制备转基因小鼠

关键词：转基因小鼠，卵母细胞，显微注射，基因修饰，胚胎操作

本文介绍了一种改良的一细胞胚胎冷冻保存方法，以及一种将冻融胚胎与电穿孔技术相结合的方案，用于高效制备基因修饰小鼠。...

利用冻融胚胎高效制备基因修饰小鼠

本实验方案描述了通过向受精卵显微注射CRISPR-Cas9系统和供体DNA，高效制备基因盒敲入和条件性敲除（floxed）小鼠的方法。...

通过受精卵显微注射在小鼠中构建基因盒敲入和Flox等位基因

本文介绍一种简单的方法，旨在高效产生名为“CRISPR RNP...

通过CRISPR显微注射对小鼠受精卵进行高效基因组编辑

本文介绍了一种利用胚胎干细胞构建基因修饰小鼠模型的实验方案，尤其适用于大片段DNA的基因敲入（KI）。该方案结合CRISPR/Cas9基因组编辑技术进行优化，与传统的依赖同源重组的线性化DNA靶向方法相比，显著提高了基因敲入效率。...

利用CRISPR/Cas9在胚胎干细胞中实现高效基因靶向以构建基因编辑小鼠模型

本方案描述了显微注射及 体内...

利用体细胞基因组编辑小鼠模型 体内 显微注射与电穿孔

本方案介绍了一种优化的遗传修饰大鼠模型制备方法。利用腺相关病毒（AAV）递送DNA修复模板，并通过电穿孔技术将CRISPR-Cas9试剂递送至2细胞期胚胎，以完成基因组编辑过程。...

利用腺相关病毒（AAV）和2细胞胚胎电穿孔技术对大鼠胚胎进行CRISPR-Cas9基因组编辑

以RNA形式递送基因组编辑器是修饰原代哺乳动物细胞和细胞系基因组的一种特别有效的方法。本方案的目标是将基因组编辑器以mRNA形式递送至原代哺乳动物细胞和细胞系中，随后通过靶向Illumina测序与分析，定量编辑结果。...

通过电穿孔递送编辑器RNA在原代哺乳动物细胞中进行基因组编辑

了解通过输卵管核酸递送进行体内电穿孔的I-GONAD方法，利用CRISPR/Cas9技术简化基因敲除小鼠的生成过程。该方法可减少实验动物使用数量，提高基因组编辑效率。

基因组编辑技术的改进通过基于输卵管核酸递送的在体内电穿孔技术用于基因敲除小鼠的制备

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