Name: 激光捕捉显微解剖对甲醛固定小鼠肝组织用于RNA分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-04-17T12:33:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: 学习激光捕捉显微解剖技术从甲醛固定小鼠肝组织中提取高质量RNA的方法。该技术可精确分离特定肝细胞亚群，用于下游转录组分析，支持慢性肝病病理研究。

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本工作部分得到了中国国家自然科学基金（82070589）、广东省自然科学基金（2022A1515010218）和广州市科技计划项目（206077078001）对王 Yan 教授的资助。我们感谢南方医科大学 biomedical research center 提供技术支持以及使用激光捕获显微切割系统的机会。

所有动物操作和护理程序均遵循伦理准则，并经南方医科大学动物伦理委员会批准。所述方法采用成年雄性 C57BL/6J 小鼠，并通过高脂、高糖、胆碱缺乏饮食诱导代谢相关性脂肪性肝炎（MASH）模型。在采集肝组织前，动物通过断头法实施安乐死。
1. PFA固定样本的制备
<ol>
	<li>将新鲜肝组织样本（单个肝叶，厚度 ≤5 mm）置于 30 mL 冰冷的 4% 多聚甲醛（PFA，现配）中，于 4 °C 固定 &#176;4 ℃孵育24小时。 
	注意：建议用磷酸盐缓冲液（PBS，1&#215;，通常由137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na&#8322;人类表型本体&#8324;，以及 1.8 mM KH&#8322;PO&#8324;，pH 7.4）溶液中于1&#215; 5分钟内进行灌注固定，随后用4% PFA灌注固定5分钟。或者，也可将组织固定于10%福尔马林溶液中。 
	警告：PFA固定液具有毒性。所有PFA废弃物必须收集至指定的、正确标记的化学废液容器中，并遵守机构及当地法规。</li>
	<li>洗涤固定后的组织样本3次&#215; 用无RNase的水洗涤5分钟，重复1次&#215; PBS 溶液</li>
	<li>将固定后的肝组织放入装有50 mL新鲜配制于无菌1×磷酸盐缓冲液中的30%蔗糖的50 mL离心管中&#215; PBS）。将样品置于4 &#176;4°C 下 10–12 小时。</li>
	<li>将组织样本从蔗糖溶液中取出，修整成易于操作的组织块（约 5 mm） &#215; 3 mm &#215; 5 毫米），然后将样本包埋于冷冻模具（7 毫米）中 &#215; 7 mm &#215; 含有OCT包埋剂的5 mm样品 
	注意：如有必要，可用镊子调整组织方向。</li>
	<li>将OCT包埋剂覆盖于组织样本上方，确保完全浸没，随后立即将OCT包埋的组织置于液氮或干冰上，快速冷冻OCT包埋剂以形成固体块。此快速冷冻步骤对于获得高质量的冷冻切片至关重要。 
	警告：操作低温材料时，需佩戴耐低温手套以保护双手。</li>
	<li>将OCT包埋的组织块置于-80 ℃保存。 &#176;直至冷冻切片前均保存于 C。</li>
</ol>
2. 用于激光捕获显微切割的冷冻切片
<ol>
	<li>将聚萘二甲酸乙二醇酯（PEN）膜载玻片暴露于紫外光下30分钟，然后用0.1 mg/mL的多聚赖氨酸包被载玻片，随后空气干燥。接着，用中性封固介质密封PEN膜载玻片的边缘。 
	注意：紫外照射和多聚赖氨酸处理PEN膜载玻片可提高组织样本在PEN膜载玻片上的附着性。用中性封固介质密封边缘可防止水分渗入或膜下产生气泡，这对维持激光捕获显微切割（LCM）效率至关重要。 
	警告：避免皮肤和眼睛暴露于紫外光。应佩戴防紫外护目镜或面罩（具备紫外防护等级），并穿戴实验服、丁腈手套和长袖衣物以遮盖暴露的皮肤。</li>
	<li>使用RNase去污染剂擦拭冷冻切片机所有可接触表面及所有工具，并用75%乙醇清洁刷子。 
	警告：废弃的乙醇擦拭材料和溶液应按照当地机构的环境健康与安全规程进行处置。</li>
	<li>使仪器降温并稳定至−20 °C。</li>
	<li>从-80 °C取出肝组织样本，放入冷冻切片机中至少15分钟。</li>
	<li>在样品台表面涂布一层薄薄的OCT包埋剂（2–3 mm）。将样品台置于速冻架（或冷冻切片机腔室）中，使OCT层预先固化。</li>
	<li>在样品台上已预固化的OCT层上再加少量OCT。取出已平衡的组织块（步骤2.4），立即水平放置于该OCT上，保持10–15秒以实现部分冻结和粘附。固定后，将带有组织块的样品台安装至冷冻切片机的样品头。</li>
	<li>从冷冻切片机一侧小心地将刀片插入夹紧板与背板之间，然后压紧夹紧杆。</li>
	<li>将冷冻切片机的切片厚度设定为10 µm。 
	注意：可根据组织需要调整切片厚度，但应保持在5–15 µm之间19。</li>
	<li>在维持于-20 °C的冷冻切片机腔室内，直接将切片切割并贴附于预处理过的PEN膜载玻片上。 
	注意：每张PEN膜载玻片可容纳6–8个组织切片。建议整个切片过程在1小时内完成。限制切片时间可最小化组织暴露于环境条件下的时间，从而降低RNA降解、组织脱水和形态学伪影的风险，这对于保持RNA质量和组织学完整性以进行LCM及后续分析至关重要。</li>
</ol>
3. 用于激光捕获显微切割的苏木精染色
<ol>
	<li>使用前于室温（RT）下解冻载玻片20分钟。</li>
	<li>用无RNase的1× PBS洗涤载玻片（每次10秒，共3次）。</li>
	<li>将组织切片浸入过滤后的Mayer's苏木精溶液（由1.0 g/L苏木精、0.2 g/L碘酸钠、50 g/L十二水合硫酸铝铵、50 g/L水合氯醛和1.0 g/L柠檬酸组成）中染色5-10秒。 
	注意：染色前需将苏木精工作液经0.22 µm注射器滤膜过滤。</li>
	<li>用无RNase的水洗涤载玻片（每次10秒，共3次），以去除残留的苏木精溶液。</li>
	<li>在显微镜下评估染色质量。 
	注意：理想染色的细胞核应呈现清晰的蓝紫色，背景透明。染色不足会导致细胞核颜色过浅，而染色过度则会掩盖细胞结构细节。只有符合上述最佳染色标准的载玻片方可进入下一步操作。</li>
	<li>用吸水纸轻轻吸干载玻片，随后完全空气干燥（10-15分钟）。 
	注意：进行激光显微切割（LCM）前，务必确保载玻片完全干燥。然后将载玻片放入50 mL离心管中，并暂时置于冰上保存，直至进行激光显微切割操作。</li>
</ol>
4. 激光捕获显微切割
注意：每张切片的激光捕获显微切割（LCM）实验时间应控制在30分钟至1小时之间。建议在4小时内完成整个LCM实验。此时间限制旨在最大限度减少室温下RNA的降解，并防止收集管盖中收集缓冲液的蒸发，这对于有效回收样本至关重要。实际操作中，可在4小时内稳定获取来自形态学定义区域的约1,000个细胞的目标产量。
<ol>
	<li>使用RNase去污染剂擦拭实验台表面。</li>
	<li>打开控制器，等待显微镜完成初始化过程。</li>
	<li>将钥匙从关闭位置顺时针旋转至开启位置，以启动激光系统。 
	注意：激光系统需要约10分钟预热时间。</li>
	<li>打开计算机并启动LCM软件，然后等待初始化过程完成。</li>
	<li>将无菌0.2 mL PCR管（收集管）插入收集装置中。</li>
	<li>向PCR管盖内加入10 µL蛋白酶K消化缓冲液（参见材料表）。 
	注意：蛋白酶K消化缓冲液的总体积将在后续步骤中（见步骤5.4.1）补至150 µL，作为完整裂解程序的一部分。</li>
	<li>将收集装置装入显微镜的样品架中。</li>
	<li>在更换收集装置窗口中，首先点击移至参考点按钮。然后调节相机焦距，确保清晰看到参考点。如有必要，使用窗口中的箭头将参考点居中于视野中。</li>
	<li>将组织切片装入样品架，确保组织切片正面朝下，标签位于右侧。</li>
	<li>选择10×物镜，识别并勾画出具有特定病理特征的感兴趣区域，例如微泡性脂肪变性（表现为肝细胞胞质内含有多个小而透明的空泡，细胞核位于中央）。然后进入激光菜单，点击校准按钮。在屏幕上确认提示信息，选择是，并继续进行校准。 
	注意：10×物镜并非微切割的唯一选择；可根据样本清晰度和所需分辨率选择其他放大倍数的物镜（如20×）。</li>
	<li>在激光控制面板中，将切割参数设置为：激光功率 = 50，孔径（激光束直径）= 5，速度 = 9。 
	注意：上述参数值是针对本方案所用组织样本的紫外激光捕获显微切割（UV-LCM）系统的参考值。其他UV-LCM系统的使用者可将其作为起始点，并可能需要根据经验调整设置。最佳参数可能因组织类型、切片厚度及其他LCM系统而异。</li>
	<li>使用图形工具栏在目标区域周围绘制一个圆圈。选择单个形状，点击开始切割按钮执行激光捕获显微切割，然后移动收集装置以收集被切割的组织。 
	注意：成功分离的标志是所选区域出现分离，通常可见间隙或碎片移动。为保持一致性，每个样本应从预定义数量、大小相似的区域进行收集。如果目标区域未自动脱离，可点击移动并切割按钮，使用鼠标手动切割样本。为更精确估算细胞数量，LCM软件可自动记录总切割面积。该数值除以目标细胞的平均横截面积，即可估算捕获的总细胞数。 
	警告：在激光捕获显微切割过程中，切勿直视激光束，以防受到激光辐射伤害。</li>
	<li>可选操作：在文件菜单中选择另存为图像命令，保存切割部位的切割前与切割后图像。在弹出对话框中选择保存位置、文件名，并以首选格式（如.tif）保存。</li>
	<li>在收集到所需数量的细胞后，点击卸载按钮，将收集装置从载物台上移除。在密封PCR管之前，确认管盖内的蛋白酶K消化缓冲液体积仍为10 µL；若在激光捕获显微切割过程中发生蒸发，需补充缓冲液（参见步骤4.6）。 
	注意：加入10 µL缓冲液可确保管盖表面充分润湿，有利于在步骤4.16的离心过程中高效转移显微切割所得的组织沉淀。</li>
	<li>充分涡旋振荡收集管。</li>
	<li>短暂离心收集管，并将样本管储存于-80 °C，直至进行RNA提取。 
	注意：对下一个样本重复步骤4.5至4.16。本方案可在RNA提取前暂停。</li>
</ol>
5. 显微切割样品的总RNA提取
<ol>
	<li>使用RNase去污染剂擦拭实验台表面。</li>
	<li>将激光捕获显微切割（LCM）样品从-80 °C冰箱转移至冰浴中。如有需要，可合并同一种类但不同批次的捕获样品。</li>
	<li>将显微切割后的样品管倒置，在42 °C孵育30分钟。 
	注意：此倒置操作可确保在短暂离心（步骤4.16）后仍粘附于管盖的组织释放至消化缓冲液中，从而在步骤5.4.1进行体积调整和高速离心前实现样品向缓冲液的最大转移。</li>
	<li>使用专为固定组织优化的标准RNA提取试剂盒（参见材料表）从LCM样品中提取总RNA。
	<ol>
		<li>用蛋白酶K消化缓冲液（参见材料表）将每个样品管的体积调整至终体积150 µL。在11,000 × g条件下离心1分钟，然后将样品转移至无菌1.5 mL离心管中。</li>
		<li>每管加入10 µL蛋白酶K（20 mg/mL），通过反复吹打轻轻混匀。最终反应体积为160 µL，每份样品消化反应中蛋白酶K终浓度约为1.25 mg/mL。</li>
		<li>进行两步孵育：先在56 °C孵育15分钟，随后在80 °C孵育15分钟。每次孵育期间，每隔5分钟短暂涡旋振荡各管一次。 
		注意：为获得最佳操作流程，建议使用两个预热的水浴锅。若仅使用一个水浴锅，则在56 °C孵育结束后暂停：将样品置于室温，待水浴升温至80 °C后再继续操作。</li>
		<li>将样品置于冰上3分钟，随后在20,000 × g条件下离心15分钟。</li>
		<li>小心吸取澄清的上清液至新的1.5 mL离心管中，避免触及沉淀。</li>
		<li>向每份样品中加入16 µL DNase孵育缓冲液和10 µL DNase I酶（2.73 单位/µL，参见材料表），然后通过轻轻颠倒混匀管内液体。最终反应体积为186 µL，每份样品中DNase I终浓度约为0.15 单位/µL。</li>
		<li>短暂离心以收集管壁残留液体。</li>
		<li>在室温下孵育样品管15分钟。</li>
		<li>向每份样品中加入320 µL高盐洗涤缓冲液（参见材料表），充分混匀。每份样品终体积为506 µL。</li>
		<li>向每管加入720 µL无水乙醇，通过移液器吹打混匀（无需离心），并立即进行后续操作。每份样品终体积为1,226 µL。 
		注意：无水乙醇高度易燃。废液中的乙醇应收集至指定的非卤化有机溶剂废液容器中，以便妥善处理。</li>
		<li>将700 µL样品混合液转移至纯化柱（置于2 mL收集管中，参见材料表）。轻轻盖紧盖子，在8,000 × g条件下离心15秒。</li>
		<li>弃去收集管中的穿流液，保留纯化柱。</li>
		<li>重复步骤5.4.11至5.4.12。</li>
		<li>向每份样品管中加入500 µL乙醇基洗涤缓冲液（参见材料表）。轻轻盖紧盖子，在8,000 × g条件下离心15秒，然后弃去收集管中的穿流液。</li>
		<li>完整重复步骤5.4.14，唯一修改为将离心时间延长至8,000 × g条件下2分钟。</li>
		<li>将每个纯化柱转移至新的2.0 mL离心管中，开盖在14,000 × g条件下离心5分钟，随后弃去离心管及残留液体。</li>
		<li>将每个纯化柱转移至新的1.5 mL离心管中，用移液器将16 µL无RNase水加至膜上，盖紧盖子，在14,000 × g条件下离心5分钟，以促进总RNA的洗脱。 
		注意：在步骤5.5和5.6期间，请将所有洗脱的RNA样品置于冰上，以防降解。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过分光光度法测定RNA样品浓度并检测纯度（A260/A280比值）。 
	注意：本步骤中的浓度与纯度（A260/A280比值）测定，结合步骤5.6中的完整性评估，构成RNA成功回收的最终定量检查点。预期获得澄清的RNA洗脱液。</li>
	<li>使用1%琼脂糖凝胶进行电泳，并利用Bioanalyzer系统测定RNA完整性数（RIN），以评估RNA质量。</li>
	<li>将RNA样品储存于-80 °C，直至进行qRT-PCR或RNA-Seq分析。</li>
</ol>
6. RNA分析
注意：qRT-PCR 在步骤 6.1 和 6.2 中描述，RNA-Seq 在步骤 6.3 中描述。
<ol>
	<li>在冰上配制反转录反应体系，每反应加入50 ng总RNA。根据提供的说明书，使用热循环仪进行反转录反应（参见材料表）。</li>
	<li>在冰上根据生产商说明书配制用于β-actin的定量PCR预混液（引物序列见材料表）。使用定量PCR系统进行实时PCR扩增，按照生产商推荐的循环程序，每反应加入10 ng cDNA。</li>
	<li>使用低起始量链特异性建库试剂盒（见材料表），从50 ng总RNA构建RNA-Seq文库。使用生物分析仪系统（见材料表）测定文库大小和浓度，随后在高通量测序平台（见材料表）上进行双端测序。</li>
</ol>

<ol><li>Shapiro, E., Biezuner, T., Linnarsson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+sequencing-based+technologies+will+revolutionize+whole-organism+science%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Single-cell sequencing-based technologies will revolutionize whole-organism science.</a> Nat Rev Genet. 14 (9), 618-630 (2013).</li>
<li>Halpern, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+spatial+reconstruction+reveals+global+division+of+labour+in+the+mammalian+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell spatial reconstruction reveals global division of labour in the mammalian liver.</a> Nature. 543 (7647), 352-356 (2017).</li>
<li>Aizarani, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+liver+cell+atlas+reveals+heterogeneity+and+epithelial+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A human liver cell atlas reveals heterogeneity and epithelial progenitors.</a> Nature. 572 (7768), 199-204 (2019).</li>
<li>Van Den Brink, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+sequencing+reveals+dissociation-induced+gene+expression+in+tissue+subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations.</a> Nat Methods. 14 (10), 935-936 (2017).</li>
<li>Baron, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Type+Purification+by+Single-Cell+Transcriptome-Trained+Sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell Type Purification by Single-Cell Transcriptome-Trained Sorting.</a> Cell. 179 (2), 527-542.e19 (2019).</li>
<li>Gross, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technologies+for+Single-Cell+Isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Technologies for Single-Cell Isolation.</a> Int J Mol Sci. 16 (8), 16897-16919 (2015).</li>
<li>Dries, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+spatial+transcriptomic+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Advances in spatial transcriptomic data analysis.</a> Genome Res. 31 (10), 1706-1718 (2021).</li>
<li>Chen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+transcriptomic+atlas+of+mouse+organogenesis+using+DNA+nanoball-patterned+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal transcriptomic atlas of mouse organogenesis using DNA nanoball-patterned arrays.</a> Cell. 185 (10), 1777-1792.e21 (2022).</li>
<li>Ståhl, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+and+analysis+of+gene+expression+in+tissue+sections+by+spatial+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualization and analysis of gene expression in tissue sections by spatial transcriptomics.</a> Science. 353 (6294), 78-82 (2016).</li>
<li>Espina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Laser-capture microdissection.</a> Nat Protoc. 1 (2), 586-603 (2006).</li>
<li>Baba, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+in+biliary+epithelial+cells+of+primary+biliary+cirrhosis+using+laser+capture+microdissection+and+cDNA+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Res%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling in biliary epithelial cells of primary biliary cirrhosis using laser capture microdissection and cDNA microarray.</a> Transl Res. 148 (3), 103-113 (2006).</li>
<li>Mena, J. E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+after+%CE%B3-glutamyl+transferase+histochemistry%3A+An+optimization+for+gene+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection after γ-glutamyl transferase histochemistry: An optimization for gene expression analysis.</a> Anal Biochem. 447, 126-132 (2014).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+RNA+Sequencing+of+Archival+Formalin-fixed+Paraffin-embedded+Urothelial+Bladder+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Urol%22%5BJournal%5D)">Next-generation RNA Sequencing of Archival Formalin-fixed Paraffin-embedded Urothelial Bladder Cancer.</a> Eur Urol. 66 (6), 982-986 (2014).</li>
<li>Ludyga, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acids+from+long-term+preserved+FFPE+tissues+are+suitable+for+downstream+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Virchows+Arch%22%5BJournal%5D)">Nucleic acids from long-term preserved FFPE tissues are suitable for downstream analyses.</a> Virchows Arch. 460 (2), 131-140 (2012).</li>
<li>Mägel, L., Bartels, S., Lehmann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-Generation+Sequencing+Analysis+of+Laser-Microdissected+Formalin-Fixed+and+Paraffin-Embedded+%28FFPE%29+Tissue+Specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Next-Generation Sequencing Analysis of Laser-Microdissected Formalin-Fixed and Paraffin-Embedded (FFPE) Tissue Specimens.</a> Methods Mol Biol. 1723, 111-118 (2018).</li>
<li>Von Ahlfen, S., Missel, A., Bendrat, K., Schlumpberger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+RNA+Quality+from+FFPE+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Determinants of RNA Quality from FFPE Samples.</a> PLoS One. 2 (12), e1261(2007).</li>
<li>Böhm, M., Wieland, I., Schütze, K., Rübben, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbeam+MOMeNT%3A+non-contact+laser+microdissection+of+membrane-mounted+native+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Microbeam MOMeNT: non-contact laser microdissection of membrane-mounted native tissue.</a> Am J Pathol. 151 (1), 63-67 (1997).</li>
<li>Schütze, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cut+out+or+poke+in--the+key+to+the+world+of+single+genes%3A+laser+micromanipulation+as+a+valuable+tool+on+the+look-out+for+the+origin+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Genet+Anal%22%5BJournal%5D)">Cut out or poke in--the key to the world of single genes: laser micromanipulation as a valuable tool on the look-out for the origin of disease.</a> Genet Anal. 14 (1), 1-8 (1997).</li>
<li>Datta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection%3A+Big+data+from+small+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Histol+Histopathol%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection: Big data from small samples.</a> Histol Histopathol. 30 (11), 1255-1269 (2015).</li>
<li>Desjardins, P., Conklin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoDrop+microvolume+quantitation+of+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids.</a> J Vis Exp. (45), e2565(2010).</li>
<li>Ge, S. J., Gan, W. Q., Karlinsey, K., Zhou, B. Y., Pachter, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immuno-laser+capture+microdissection+of+perfusion-fixed+mouse+brain+tissue+coupled+to+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Immuno-laser capture microdissection of perfusion-fixed mouse brain tissue coupled to RNA-seq.</a> J Neurosci Methods. 423, 110548(2025).</li>
<li>Takahashi, K., Beltran, W. A., Sudharsan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+workflow+for+transcriptomic+analysis+from+archival+paraformaldehyde-fixed+retinal+tissues+collected+by+laser+capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">An optimized workflow for transcriptomic analysis from archival paraformaldehyde-fixed retinal tissues collected by laser capture microdissection.</a> Exp Eye Res. 246, 109989(2024).</li>
<li>Mahalingam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+Capture+Microdissection%3A+Insights+into+Methods+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Laser Capture Microdissection: Insights into Methods and Applications.</a> Methods Mol Biol. 1723, 1-17 (2018).</li>
<li>Kim, S. O., Kim, J., Okajima, T., Cho, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+paraformaldehyde-treated+individual+cells+investigated+by+atomic+force+microscopy+and+scanning+ion+conductance+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Converg%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of paraformaldehyde-treated individual cells investigated by atomic force microscopy and scanning ion conductance microscopy.</a> Nano Converg. 4 (1), (2017).</li>
<li>Erickson, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+RT-PCR+gene+expression+analysis+of+laser+microdissected+tissue+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Quantitative RT-PCR gene expression analysis of laser microdissected tissue samples.</a> Nat Protoc. 4 (6), 902-922 (2009).</li>
<li>Pan, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+Capture+Microdissection-Based+RNA+Microsequencing+Reveals+Optic+Nerve+Crush-Related+Early+mRNA+Alterations+in+Retinal+Ganglion+Cell+Layer%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Vis+Sci+Technol%22%5BJournal%5D)">Laser Capture Microdissection-Based RNA Microsequencing Reveals Optic Nerve Crush-Related Early mRNA Alterations in Retinal Ganglion Cell Layer.</a> Transl Vis Sci Technol. 9 (11), 30(2020).</li>
<li>Civita, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+Capture+Microdissection+and+RNA-Seq+Analysis%3A+High+Sensitivity+Approaches+to+Explain+Histopathological+Heterogeneity+in+Human+Glioblastoma+FFPE+Archived+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">Laser Capture Microdissection and RNA-Seq Analysis: High Sensitivity Approaches to Explain Histopathological Heterogeneity in Human Glioblastoma FFPE Archived Tissues.</a> Front Oncol. 9, 482(2019).</li>
<li>Phan, H. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+RNA+sequencing+of+paraformaldehyde-fixed+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">High-throughput RNA sequencing of paraformaldehyde-fixed single cells.</a> Nat Commun. 12 (1), 5636(2021).</li>
<li>Thomsen, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixed+single-cell+transcriptomic+characterization+of+human+radial+glial+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fixed single-cell transcriptomic characterization of human radial glial diversity.</a> Nat Methods. 13 (1), 87-93 (2016).</li>
<li>Lin, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+analysis+of+RNA+sequencing+methods+with+ribosome+RNA+depletion+for+degraded+and+low-input+total+RNA+from+formalin-fixed+and+paraffin-embedded+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Bmc+Genomics%22%5BJournal%5D)">A comparative analysis of RNA sequencing methods with ribosome RNA depletion for degraded and low-input total RNA from formalin-fixed and paraffin-embedded samples.</a> Bmc Genomics. 20 (1), 831(2019).</li>
<li>Luzzi, V., Mahadevappa, M., Raja, R., Warrington, J. A., Watson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+and+reproducible+gene+expression+profiles+from+laser+capture+microdissection%2C+transcript+amplification%2C+and+high+density+oligonucleotide+microarray+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">Accurate and reproducible gene expression profiles from laser capture microdissection, transcript amplification, and high density oligonucleotide microarray analysis.</a> J Mol Diagn. 5 (1), 9-14 (2003).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

LCM 的优势在于其精确性， 原位 特定细胞或组织区域的捕获，有助于对异质性组织内特定区域的研究。但该技术存在样本得率低、耗时长、成本高以及需要专用设备等局限性，限制了其在实验室中的广泛应用23本研究建立了LCM-RNA实验方案，以克服以往的关键技术局限。该方案采用快速苏木精染色步骤（约10秒），并通过使用PFA/OCT包埋替代FFPE，避免了多种固定组织方案中耗时的二甲苯脱蜡步骤。单管收集策略避免了中间转移过程，减少了样本损失和移液操作。使用封片介质密封膜的边缘可防止常见的水化问题，提高首次操作成功率并提升实验效率22通过使用适配PFA的RNA提取试剂盒，确保了交联RNA的高效回收。结合超灵敏文库构建试剂盒，该方法能够成功从皮克量级的RNA产出中提取RNA。此外，组织切片厚度设定为5-15 µm。上述参数选择得到了先前方法学研究的支持。10,19切片厚度小于5 µm可能无法提供完整的细胞轮廓，从而影响可靠捕...

准确获取空间分辨的基因表达谱对于理解健康和疾病状态下的组织异质性至关重要。单细胞RNA测序（scRNA-seq）具有高细胞分辨率1,2，但会丢失原有的空间位置信息，并可能在组织解离过程中改变转录谱3,4对于缺乏公开明确特异性标志物的细胞类型，仍难以通过基于免疫荧光的分选或免疫磁珠分离方法获得纯细胞群体5,6空间转录组学技术（如 Visium 和 GeoMx）可实现 原位 获取高通量基因表达数据，但其在单细胞或亚细胞水平上的空间分辨率有限7,8相反，基于成像的空间转录组学可实现纳米级分辨率，但其基因检测通量有限9这凸显了在特定形态学区域进行假设驱动分析方面长期存在的空白。
激光捕获显微切割（LCM）技术可在显微镜引导下，根据可观察的表型特征，从组织切片或活细胞培养物中选择并分离特定细胞。该方法能够保持细胞结构和空间信息10。该技术已在肝脏疾病研究中广泛应用于下游分析。例如，LCM 已被用于从肝活检组织中收集胆管上皮细胞，以阐明其在原发性胆汁性胆管炎中的免疫调节作用11。此外，该技术还被用于从实验模型中分离γ-谷氨酰转移酶（GGT）阳性组织，以确认位点特异性的Ggt1基因表达12。然而，这些研究主要集中在新鲜冷冻组织上，而此类样本通常缺乏临床注释或长期随访信息13。相比之下，化学固定的组织更有利于组织病理学诊断14。尽管基于LCM的RNA测序（RNA-Seq）已成功应用于存档的大规模福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）肝组织样本15，但目前仍缺乏专门针对多聚甲醛（PFA）固定并包埋于最佳切割温度（OCT）化合物中的肝组织微小样本的可靠LCM基因表达谱分析方案。
为解决这一尚未满足的需求，本研究优化了一种使用PFA固定、OCT包埋的冷冻切片的全面操作方案。该方案克服了福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）流程在敏感性激光显微切割- RNA（LCM-RNA）应用中的局限性（例如处理时间长、使用剧烈化学试剂）16。相比之下，PFA固定并经OCT包埋的样本其固定与包埋过程相对简便且灵活，能够快速制备高质量切片，同时保持RNA完整性与组织形态。此外，本方案采用基于紫外（UV）激光的激光显微切割系统。与红外系统相比，紫外激光显微切割（UV-LCM）具有更高的切割分辨率，可实现无接触式直接样本采集，最大限度减少污染，适用于从复杂组织结构中精确分离微小区域17,18。因此，本方案的操作价值在于能够从PFA固定的肝组织切片中，以保持形态学特征的前提下捕获微尺度区域（约1,000个细胞），所获得的RNA适用于靶向基因表达分析，从而实现组织病理学特征与局部转录组谱之间的直接关联。
本文介绍了一种从PFA固定、OCT包埋的小鼠肝脏切片中进行激光显微切割分离微小组织（约1,000个细胞）的实验方案，随后提取RNA，并通过定量反转录PCR和RNA测序进行下游分析。这些操作可在五天内完成。
为了帮助读者评估本实验方案的适用性，以下总结了其主要适用范围与局限性。本方案专为基于假设、形态学引导的特定组织学区域取样而优化，适用于经PFA固定、OCT包埋的组织样本，主要应用对象为小鼠肝脏。该方案适合需要将空间分辨的转录组数据与固定样本中保存的精确组织病理学特征相关联的研究人员。当研究涉及存档样本或具有临床注释的固定组织，且无法获得新鲜冷冻样本时，该工作流程尤为有价值。然而，本方案不适用于需要高完整性、非片段化RNA的研究（例如RNA完整性数值（RIN）&#62; 8），因为化学固定所导致的RNA固有片段化限制了其在依赖全长转录本的应用中的使用。

<table><tbody><tr><td>&lt;强&gt;材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2 ml 薄壁管</td><td>Axygen</td><td>PCR-02-C</td><td>用于LCM收集的管子</td></tr><tr><td>1.5 mL 离心管</td><td>Axygen</td><td>339653</td><td></td></tr><tr><td>4% 多聚甲醛</td><td>Leagene</td><td>DF0135</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>339653</td><td></td></tr><tr><td>DEPC（焦碳酸二乙酯）</td><td>Sigma</td><td>D-5758</td><td></td></tr><tr><td>DNase I 消化试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>73504</td><td>RNeasy FFPE 试剂盒组分，包含 DNase I 储存液和 DNase 增强缓冲液</td></tr><tr><td>乙醇（100%）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>BP2818</td><td>分子生物学纯化</td></tr><tr><td>基于乙醇的洗涤缓冲液</td><td>Qiagen</td><td>73504</td><td>Buffer RPE（RNeasy FFPE试剂盒组分）</td></tr><tr><td>高盐洗涤缓冲液</td><td>Qiagen</td><td>73504</td><td>缓冲红细胞（RNeasy FFPE 试剂盒组分）</td></tr><tr><td>低剖面切片机刀片</td><td>Leica Biosystems</td><td>819</td><td></td></tr><tr><td>Mayer&amp;rsquo;苏木精染色</td><td>Leagene</td><td>DH0001</td><td></td></tr><tr><td>OCT包埋剂</td><td>樱花</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯膜包被载玻片</td><td>Leica</td><td>11505188</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Leagene</td><td>CC0010</td><td>无DNase/RNase</td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸</td><td>Macklin</td><td>P875131S</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶K消化缓冲液</td><td>Qiagen</td><td>73504</td><td>Buffer PKD（RNeasy FFPE 试剂盒组分）</td></tr><tr><td>纯化柱</td><td>Qiagen</td><td>73504</td><td>RNeasy MinElute 离心柱（RNeasy FFPE 试剂盒组分）</td></tr><tr><td>定量PCR预混液</td><td>Takara Bio</td><td>RR820A</td><td>TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)</td></tr><tr><td>逆转录试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>205411</td><td>QuantiNova 反转录试剂盒</td></tr><tr><td>RNA提取试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>73504</td><td>RNeasy FFPE 试剂盒</td></tr><tr><td>低输入量链特异性RNA测序试剂盒</td><td>Takara Bio</td><td>634412</td><td>SMARTer链特异性总RNA测序试剂盒 - 超低起始量哺乳动物v2</td></tr><tr><td>RNase 去污染剂</td><td>Solarbio</td><td>SR0040</td><td>清洗</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Macklin</td><td>S818049</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;动物与饮食&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>小鼠：C57BL/6J</td><td>广东省实验动物中心</td><td>03</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;特殊饮食 &amp;和饮用水&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>高脂、胆碱缺乏饮食（基础饮食）</td><td>TROPHIC 动物饲料高科技有限公司</td><td>TP36310M</td><td>宏量营养素：蛋白质，14 kcal%；碳水化合物，26 kcal%；脂肪，60 kcal%</td></tr><tr><td>含糖饮用水</td><td>Macklin</td><td>N/A（实验室自制）</td><td>将D-葡萄糖（Macklin，货号# F87500）和D-果糖（Macklin，货号# S818049）的混合物加入已灭菌的饮水中，终浓度为42 g/L，葡萄糖与果糖的质量比为55:45。</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;小鼠引物&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;&amp;beta;-肌动蛋白&lt;/em&gt; （正向：AGAGGGAAATCGTGCGTGAC）</td><td>BGI 测序</td><td>定制化</td><td>HPLC 纯化</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;&amp;beta;-肌动蛋白&lt;/em&gt; （反向：CAATAGTGATGACCTGGCCGT）</td><td>BGI 测序</td><td>定制化</td><td>HPLC 纯化</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;仪器设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>冷冻切片机</td><td>Leica Biosystems</td><td>CM3050 S</td><td></td></tr><tr><td>生物分析系统</td><td>安捷伦</td><td>G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>高通量测序平台</td><td>Illumina公司</td><td>NovaSeq 6000 系统</td><td></td></tr><tr><td>激光捕获显微切割系统</td><td>徕卡显微系统</td><td>Leica LMD6500</td><td></td></tr><tr><td>定量PCR系统</td><td>应用生物系统公司</td><td>QuantStudio 5 实时荧光定量 PCR 系统</td><td></td></tr><tr><td>分光光度计</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>NP80</td><td>NanoDrop</td></tr><tr><td>热循环仪</td><td>伯乐（BioRad）</td><td>T100</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;软件&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adobe Illustrator CC 2019（版本 23.0.2）</td><td>Adobe</td><td>https://www.adobe.com/products/illustrator.html</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism（版本 8.3.0）</td><td>GraphPad Software</td><td>https://www.graphpad.com</td><td></td></tr></tbody></table>

激光捕获显微切割用于rna分析的多聚甲醛固定小鼠肝组织

Laser Capture Microdissection of Paraformaldehyde-Fixed Mouse Liver Tissue for RNA Analysis

激光捕获显微切割（LCM）通过复杂组织中特定细胞群体的空间定位，实现对其的精确获取 原位 可视化与分离。为实现对固定组织中经组织学界定区域的转录组学分析，本文提供了一项详细的激光显微切割（LCM）方案，用于从多聚甲醛（PFA）固定、OCT包埋的小鼠肝脏切片中提取RNA。该方案详细描述了通过一系列流程识别并采集微尺度样本（约1,000个细胞），包括组织固定、蔗糖脱水、OCT包埋、冷冻切片、苏木精染色以及靶向组织区域的激光捕获。采用此方法可获得高纯度RNA（A260/A280：1.9-2.1）获得。RNA完整性指数（RIN）为6.7 ± 0.9，反映了与PFA固定相关的预期片段化程度。然而，定量PCR用于 β-actin 获得的Ct值为17-19，采用片段化优化的文库制备方法进行RNA测序，产生了高质量的读长，且 &#62;90% 的碱基达到 Q20 和 Q30 阈值，证实该 RNA 适用于高灵敏度的下游分析。因此，本方案通过从 PFA 固定的肝组织特定组织学区域获取具有明确纯度和完整性的 RNA，实现了空间分辨的靶向基因表达分析。

实验流程包括PFA固定、30%蔗糖脱水、OCT包埋和冷冻切片、苏木精染色、通过激光显微切割技术（LCM）识别并精确采集目标区域（约1,000个细胞）、细胞裂解、RNA提取、RNA质量控制指标，以及两个关键的分析应用，如图1所示。在激光捕获微尺度肝组织前后，PEN载玻片上经苏木精染色的肝组织切片在显微镜下的图像分别如图2A和图2B所示。表现出微泡性脂肪变性的感兴趣区域被精确采集至PCR管盖中，同时保持了完整的细胞形态（图2C）。
每份重复实验分别从约 1,000 和 2,000 个激光显微切割捕获的细胞中提取总 RNA，产量分别为 110.7 ± 11.8 ng 和 213.3 ± 26.2 ng（图 3A）。所有样本均显示高纯度，A260/A280</su...

本方案描述了一种利用激光捕获显微切割技术，从经多聚甲醛固定、OCT包埋的小鼠肝组织中分离特定组织学区域RNA的方法，可用于靶向性的下游基因表达分析。

激光捕获显微切割用于RNA分析的多聚甲醛固定小鼠肝组织

激光捕获显微切割（LCM）通过原位可视化，实现对复杂组织内特定细胞群体的空间性分离与获取。

我们的研究主要探讨慢性肝病背景下与肝细胞相关的病理生理学。本方案可实现肝组织切片中的细胞分离及RNA提取。与FFPE或甲醛固定相比，CT方案能够保存并整合细胞结构，从而实现精确的显微观察，并为后续的OMI分析提供高质量的样本。首先，将带有膜的载玻片暴露于紫外线下照射 30 分钟。用浓度为 0.1 毫克/毫升的多聚-L-赖氨酸包被载玻片，并使其自然风干。用中性封片剂密封每张载玻片的边缘。使用 RNase 去污染试剂擦拭冷冻切片机所有可接触的表面及所有工具。使用 75% 乙醇清洁毛刷和工具，确保彻底清洁。现在，将冷冻切片机的温度设置为零下20摄氏度，并使其稳定。从零下80摄氏度的储存环境中取出肝组织样本，放入冷冻切片机腔室中，至少平衡15分钟。在样本台上涂抹一层2至3毫米厚的OCT包埋剂。然后将样本台置于速冻架上或冷冻切片机腔体内，使包埋剂层预先固化。在已预固化的包埋剂层上再加少量OCT包埋剂后，将平衡至室温的组织块水平放置于包埋剂上，并固定10至15秒。然后将带有已固定组织块的切片台安装到冷冻切片机的样品头上。现在从冷冻切片机的一侧小心地将刀片插入夹紧板与背板之间。压下夹紧杠杆以固定刀片。将冷冻切片机的切片厚度设置为10微米。将组织切成切片，并直接贴附于冷冻切片机腔室内预处理过的膜片载玻片上，腔室温度维持在零下20摄氏度。将载玻片在室温下解冻20分钟。用无RN ACE的PBS缓冲液清洗载玻片三次，每次10秒。将过滤后的Mayer苏木精溶液加入组织切片中，染色5至10秒。然后用无RNase的水清洗载玻片三次，每次10秒，以去除残留的苏木精。在显微镜下评估染色质量。使用吸水纸将玻片 blot 干，并使其完全空气干燥。用 RNase 去污染试剂擦拭实验台表面。打开控制器并等待显微镜完成初始化。将钥匙从关闭位置顺时针旋转至开启位置，以启动激光系统。打开计算机并启动激光显微切割软件。然后等待初始化完成。现在将一支无菌的 0.2 毫升 PCR 管插入收集装置中。使用移液器将 10 微升蛋白酶 K 消化缓冲液加入 PCR 管盖内。将收集装置装入显微镜的样本架中。在更换收集装置窗口中，进入调整参考点界面，调节相机焦距以清晰观察参考点，并在必要时使用箭头控制将其居中。将组织切片放入样本架中，组织面朝下，标签位置朝右。选择10倍物镜，识别具有特定病理特征的兴趣区域。进入激光菜单。单击校准，选择“是”并完成校准。在激光控制面板中，将激光功率设为50，光圈设为5，速度设为9。然后使用图形工具栏在目标区域周围绘制一个圆。选择单一形状，按下“开始切割”以执行激光显微切割，并定位收集装置以获取切割的组织。为获取记录图像，请选择文件并选择“保存图像”，以保存切割前后的图像至所需格式。收集完目标细胞后，单击“卸载”以将收集器从载物台上移除。确认蛋白酶K消化缓冲液在管盖中剩余10微升，必要时补充。盖紧管盖并充分涡旋混匀，然后在离心机中短暂离心。将试管于-80摄氏度保存，直至进行RNA提取。使用显微镜观察笔式载玻片上经苏木精染色的肝组织切片，在激光捕获显微切割前后均进行观察。显微镜下显示微泡性脂肪变性的目标区域被精确采集至PCR管盖中。保持完整的细胞形态。从约1000个和2000个激光显微切割分离的细胞中提取的总核糖核酸分别获得110.7纳克和213.3纳克。所有样品均显示高纯度，260纳米与280纳米吸光度比值介于1.9至2.1之间。凝胶电泳显示出清晰的28 s和18 s核糖体核糖核酸条带。仅来自1000个细胞的核糖核酸的Bioanalyzer图谱，其核糖核酸完整性数值为6.7。内参基因Beta actin的Q-R-T-P-C-R扩增得到的循环阈值（Ct值）范围为17至19。使用50纳克总核糖核酸构建的测序文库经Bioanalyzer检测显示，在300至500个碱基对之间出现特征性峰。对这些文库进行RNA测序后获得了高质量数据，Q20和Q30得分均超过90%，且在重复样本中表现出较低的错误率。一个重要考虑因素是在处理过程中通过控制终止、快速染色和直接操作条件来防止抗体降解。按此流程操作，可用于实时 PCR 以及经片段化优化文库接头的测序。该方法已在肝组织样本中建立。 本方案可实现肝细胞亚群的分析表征，并支持以病理学为重点的肝脏病学研究。

laser-capture-microdissection-paraformaldehyde-fixed-mouse-liver

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

激光捕捉显微解剖对甲醛固定小鼠肝组织用于RNA分析

对小鼠脑部特定区域进行RNA表达谱分析，需要精确且可重复的组织采集策略。本文描述了一种结合冠状面脑切片与组织打孔器辅助显微解剖的技术方案。从所获样本中提取的总RNA产量与质量验证了该方法的实用性。...

一种无需激光捕获显微切割的小鼠脑区精细分离方法，用于总RNA提取及后续的高通量测序与基因表达谱分析

对特定组织中部分细胞的基因表达进行分析是一项重大挑战。本文介绍了如何通过将快速免疫标记方法与激光显微切割技术相结合，从特定细胞群体中分离高质量的总RNA。...

使用激光捕获显微切割结合快速免疫标记法从特定细胞亚群中分离RNA

本文介绍一种简化的微小RNA（miRNA）表达分析方案，适用于存档的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）或新鲜冷冻的前列腺癌（PCa）临床组织样本，采用定量实时聚合酶链式反应（RT-PCR）进行检测。 原位...

前列腺癌临床组织中的miRNA表达分析

本实验方案的目的是利用激光捕获显微切割技术，从异质性前列腺组织中有效分离出特定细胞类型的纯群体，用于后续的RNA分析。...

激光捕获显微切割人前列腺上皮组织用于RNA分析

本文介绍了一种可重复的激光显微切割（LCM）实验方案，用于分离小梁网（TM）组织以进行后续RNA分析。对小梁网基因表达变化的分析能力将有助于理解与小梁网相关眼病的潜在分子机制。...

从小鼠眼球中激光捕获显微切割高纯度小梁网用于基因表达分析

我们提出一种稳健、经济且灵活的方法，用于检测固定或冷冻保存的组织样本中肝细胞数量和细胞核倍性的变化，该方法无需流式细胞术。本方法可提供理想的全样本肝脏细胞学特征，适用于追踪肝损伤和肝脏疾病的进展过程。...

一种用于评估小鼠肝细胞核多倍性的高通量原位方法

已建立一种激光捕获显微切割（LCM）方案，用于从骨细胞中获取足量且高质量的RNA，以进行基因表达分析。本研究主要针对小鼠股骨切片。然而，此处报道的LCM方案也可用于研究任何硬组织细胞中的基因表达。...

一种可从新鲜冷冻小鼠骨组织中获得高质量RNA的激光捕获显微切割方案

核糖体亲和纯化技术（TRAP）能够快速高效地分离特定细胞类型的翻译中mRNA。在此，我们展示了一种方法，该方法结合了在肝细胞再生小鼠模型中进行的水动力尾静脉注射与TRAP技术，以检测再生肝细胞的基因表达谱。...

小鼠肝脏中细胞类型特异性基因表达谱分析

本方案描述了利用激光显微切割技术从新鲜冷冻的小鼠胚胎切片中分离软骨和骨组织的方法。通过焦宁Y染色可快速可视化软骨和骨组织，并可精确采集，以获得高质量的RNA用于转录组分析。...

激光捕获显微切割小鼠胚胎软骨与骨骼用于基因表达分析

激光显微切割（LMD）是一种灵敏且高度可重复的技术，可用于揭示介导胶质瘤异质性和侵袭性的分子通路。本文中，我们描述了一种优化的实验方案，通过激光显微切割从胶质瘤组织中分离特定区域，并随后进行转录组学分析。...

激光捕获显微切割胶质瘤亚区域用于肿瘤内异质性、肿瘤微流及侵袭的空间与分子特征分析

本文介绍了一种植物组织激光显微切割（LCM）的实验方案。LCM是一种用于无污染地分离特定组织区域的显微技术。该操作流程包括组织固定、石蜡包埋、切片、激光显微切割以及RNA提取。所获得的RNA可用于后续组织特异性、时间分辨的转录组分析。...

激光捕获显微切割结合RNA测序用于植物时空特异性组织基因表达分析

学习激光捕捉显微解剖技术从甲醛固定小鼠肝组织中提取高质量RNA的方法。该技术可精确分离特定肝细胞亚群，用于下游转录组分析，支持慢性肝病病理研究。

激光捕获显微切割用于RNA分析的多聚甲醛固定小鼠肝组织

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