Name: 高效分离猪脂肪组织中脂肪来源的干细胞和脂肪细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-05-26T13:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: 了解利用酶解与机械波联合技术从猪脂肪组织中高效分离脂肪来源干细胞和脂肪细胞的方法。该方案可在30分钟内完成，细胞存活率达80-95%，适用于再生医学研究。

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本工作得到了国家自然科学基金（李 M：32421005 和 32225046，卢 L：32472857）；中国西藏自治区科技项目（XZ202501ZY0147，负责人：M.L.）；中国博士后科学基金（卢 L：2024M763881）；重庆市博士后特别资助（卢 L：2023CQBSHTB3098）；国家级/省级大学生创新创业训练计划项目（卢 L：202510626001）；以及农业科技重大项目的支持。

所有动物实验均按照 实验动物管理规定 （中国科学技术部，2017年3月修订），并经四川农业大学动物伦理与福利委员会批准（许可编号：20230089）。本方案需使用SoniConvert系统，一种 commercially available 的用于机械波辅助组织解离的设备（下文简称机械解离系统）。该方案针对猪脂肪组织进行了优化，且对这一专用设备的依赖是其主要局限性。
1. 脂肪组织的采集与制备
<ol>
	<li>术前消毒与备皮
	<ol>
		<li>通过静脉注射过量戊巴比妥钠（100 mg/kg 体重）处死猪。在组织采集前确认动物死亡。</li>
		<li>使用无菌纱布蘸取2%碘伏，从背部中线向两侧各延伸15 cm进行螺旋式消毒。静置晾干30秒。</li>
		<li>使用无菌剃刀剃除16 cm × 8 cm区域内的毛发，确保手术区域无残留毛发。</li>
		<li>用无菌纱布蘸75%乙醇擦拭背部2次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>脂肪组织采集
	<ol>
		<li>使用无菌手术刀沿背部正中线做20 cm横向切口。</li>
		<li>用无菌镊子提起切口边缘，沿脂肪组织与真皮之间的自然解剖平面进行分离，获取一层完整、厚度约2–3 mm的背部皮下脂肪上层（ULB）组织片。</li>
		<li>用冰镇无菌生理盐水冲洗ULB组织一次，并将其置于无菌培养皿中（图2）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="猪的解剖过程；解剖图示，标注的层次结构，培养皿中的已解剖组织。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70464/70464fig2.jpg" data-altupdatedat="1782187231000" data-alt="图2"> 
图2：猪背浅层脂肪组织（ULB）的采集以用于细胞分离。（A） 猪背部脂肪组织结构示意图；（B）巴马香猪的切割部位； （C）背部脂肪组织展示，猪背皮下脂肪包含两层，上层（ULB）和内层（ILB）； （D）采集的ULB组织。缩写：ULB = 背部上层脂肪；ILB = 背部内层脂肪。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70464/70464fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
暂停点：收集的脂肪组织可在冰上预冷的无菌生理盐水或D-Hanks溶液中于4 °C短期保存，以便后续解剖。 
注意：目标是收集背部皮下脂肪组织的上层（ULB）。解剖过程中应避免混入背部皮下脂肪组织的下层（ILB）。
<ol start="3">
	<li>脂肪组织的解剖与清洗
	<ol>
		<li>每1.8 g组织向培养皿中加入10 mL冰冻的D-Hanks缓冲液，确保组织完全浸没。</li>
		<li>使用无菌外科剪刀识别并切除组织中所有可见的血管，去除结缔组织和纤维化成分。将切除的材料丢弃至指定的生物危害容器中。 
		注意：操作锐利器械时需格外小心；始终远离身体方向进行切割，使用后的刀片和剪刀应立即丢弃至锐器容器中。</li>
		<li>在D-Hanks缓冲液中冲洗组织，以去除残留血液和碎片。 
		注意：对于血肿较多的样本，可根据需要更换缓冲液1–3次，直至溶液视觉上澄清。所有解剖步骤均需在冰上操作，以维持组织活性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>脂肪组织的机械解离
	<ol>
		<li>将1.8 g经冲洗的组织碎片转移至无菌的1.5 mL微量离心管中。向管中加入800 µL A型组织解离缓冲液（A-Buffer）。</li>
		<li>使用无菌眼科剪刀在管内将组织剪切成约1–2 mm3大小的小块。 
		注意：若在剪切过程中或之后观察到明显的脂质泄漏，应在进行酶解消化前用1 mL预冷的D-Hanks溶液再次洗涤组织，以去除破裂脂肪细胞释放的脂质。此步骤有助于保持脂肪细胞的完整性，便于后续分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 细胞分离与匀浆
<ol>
	<li>酶解处理
	<ol>
		<li>向新的微量离心管中加入 200 µL A型组织解离试剂（A型溶液）。用手轻轻旋转并摇晃管体3次，混匀内容物，确保脂肪组织碎片完全浸没在解离溶液中。</li>
		<li>确认管盖已紧密封闭。将管子放入37 °C金属浴中，孵育5–10分钟。 
		​​注意：请观察溶液直至变得浑浊，且组织碎片呈现部分消化状态。A型溶液含有胶原酶和中性蛋白酶。操作时需佩戴腈类手套、实验服和护目镜。避免皮肤接触；若发生接触，应立即用大量水冲洗15分钟。加入A型溶液后，A缓冲液不得丢弃。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>超声辅助机械解离
	<ol>
		<li>将部分消化的脂肪组织碎片连同周围缓冲液从微量离心管转移至专用于机械解离系统的无菌1.5 mL微量离心管中。</li>
		<li>在机械解离系统中运行预设的脂肪组织程序，使用200 Hz正弦波进行机械解离。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 过滤以获得单细胞悬液
<ol>
	<li>过滤与离心
	<ol>
		<li>收集细胞悬液，通过200 µm细胞筛网过滤至新的50 mL离心管中，以去除大块碎片和未消化的组织团块。</li>
		<li>向筛网中加入5 mL预冷（4 °C）的D-Hanks溶液，用D-Hanks溶液冲洗筛网2次，以最大程度回收细胞。</li>
		<li>将过滤后的细胞悬液在4 °C条件下以500 × g离心5分钟。 
		暂停点：离心后可立即进行后续操作，或在冰上短暂保存，再进行分层分离。</li>
		<li>脂肪细胞收集：使用无菌巴斯德吸管吸除并弃去上层脂质层，保留约1 mL缓冲液以保护脂肪细胞层。收集第二层用于脂肪细胞的下游分析。注意避免扰动第三层和第四层。</li>
		<li>基质血管组分（SVF）收集：去除上层液体后，用1 mL D-Hanks/PBS轻轻重悬底部含有基质血管组分（SVF）的沉淀。轻柔重悬细胞沉淀，使其细胞浓度达到2–5 × 106 个细胞/mL。 
		注：理想情况下，离心后可观察到四层结构：最上层为脂质层；第二层为脂肪细胞层；第三层为亲水性缓冲液层；最底层为SVF层，含有干细胞（图1）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>红细胞裂解
	<ol>
		<li>注：若细胞沉淀呈现明显红色，提示存在红细胞污染，需进行红细胞裂解。 
		使用带宽口吸头的P1000移液器，将细胞沉淀重悬于1–3 mL红细胞裂解缓冲液（RBC lysis buffer）中，冰上孵育15分钟，期间偶尔混匀。</li>
		<li>将所有溶液及离心机转子预冷至4 °C，以尽量减少处理过程中的细胞代谢活性。</li>
		<li>在4 °C条件下以500 × g离心10分钟，彻底吸除上清液。</li>
		<li>用5 mL预冷的D-Hanks溶液重悬细胞沉淀，洗涤一次，随后在4 °C条件下以500 × g离心5分钟，弃去上清液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>最终重悬
	<ol>
		<li>将最终的细胞沉淀重悬于D-Hanks/PBS中，用于后续实验应用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 下游应用与分析
<ol>
	<li>SVF 细胞活力与细胞得率评估
	<ol>
		<li>将获得的 SVF 细胞悬液置于 1.5 mL 微量离心管中。使用前保持冰上放置。</li>
		<li>在无菌的 0.5 mL 微量离心管中，混合 10 µL SVF 细胞悬液与 10 µL 0.4% 台盼蓝溶液。轻柔吹打 3 次以确保均匀混合。 
		注意：混合液中台盼蓝的最终浓度为 0.2%。混合过程中避免引入气泡，以免干扰自动细胞计数。 
		取 10 µL 染色后的细胞混合液加入适用于自动细胞计数仪的计数板中。确保样本完全充满计数室且无溢出。</li>
		<li>将计数板插入细胞计数仪中。选择台盼蓝检测模式，并根据需要调整细胞浓度范围。</li>
		<li>按下“计数”按钮以启动自动细胞计数。仪器将捕获计数室的图像，并自动区分活细胞与死细胞。</li>
		<li>记录仪器屏幕上显示的细胞活力百分比及活细胞总数。每个样本进行三次独立测量，并计算每克脂肪组织的平均细胞活力和细胞得率。 
		​注意：每次使用后，用 70% 乙醇清洁计数板和仪器加样口，以防止样本间的交叉污染。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>脂肪细胞形态学观察
	<ol>
		<li>在 D-Hanks/PBS 中，使用 5 µg/mL Hoechst 染细胞核，1 µM BODIPY 染脂质，37 °C 孵育 15 分钟。 
		暂停点：染色后应尽快成像；如需延迟，可将样本避光短期保存于 4 °C，随后进行显微观察。</li>
		<li>使用自制的脂肪细胞友好型载玻片-盖玻片系统制备样本，以避免细胞受压变形。</li>
		<li>在荧光显微镜下观察细胞核（Hoechst 染色）和脂滴（BODIPY 染色）。 
		注意：由于脂肪细胞体积较大（20–300 µm）且脂质含量高，细胞脆弱、易漂浮并堆叠成多层，常规封片方法难以实现清晰的显微观察（图 3A）。为此，开发了一种使用标准载玻片和盖玻片的自制脂肪细胞友好型封片系统（图 3B）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>基质血管组分的纯化及 ADSCs 的形态学观察
	<ol>
		<li>将新鲜分离的 SVF 接种至含 5 mL DMEM 培养基的 T25 培养瓶中，培养基中添加 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素-链霉素。于 37 °C、5% CO₂ 条件下培养。</li>
		<li>48 小时后，用预热的 PBS 轻柔洗涤培养瓶两次，以去除未贴壁细胞。加入新鲜培养基继续培养。</li>
		<li>每 2–3 天更换一次培养基。在倒置显微镜下监测细胞形态和融合度。</li>
		<li>当细胞融合度达到 80–90%（通常在 7–10 天后），在 37 °C 下使用 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 消化 3–5 分钟，用培养基中和后收集细胞悬液。</li>
		<li>在进行流式细胞术检测和分选前，进行台盼蓝染色以检测细胞活力。</li>
		<li>在光学显微镜下观察纯化后培养的 ADSCs 的形态。</li>
		<li>将收集的细胞悬液通过 70 µm 细胞筛过滤，以去除残留的细胞团块。用含 2% FBS 的 PBS 重悬细胞，用于流式细胞术分析。</li>
		<li>在 4 °C 避光条件下，使用荧光素标记的抗 CD73、CD90、CD11b 和 CD45 抗体染色 30 分钟。</li>
		<li>用染色缓冲液洗涤细胞两次，再用含 2% FBS 的 PBS 重悬。</li>
		<li>使用 70 µm 喷嘴、20 psi 压力和低于 3.0 的流速进行流式细胞术分析。</li>
		<li>通过前向散射面积（FSC-A）和侧向散射面积（SSC-A）参数设门，排除细胞碎片。</li>
		<li>通过 FSC-A 与 FSC-H 设门去除双联体，并选择活单细胞群体用于后续分析。</li>
		<li>根据表面标志物表达分析设门后的细胞。以 CD73 和 CD90 为阳性标志物，CD11b 和 CD45 为阴性标志物，验证 ADSC 表型。</li>
		<li>在光学显微镜下观察富集并培养的 ADSCs 形态。典型的纺锤形、成纤维细胞样形态表明 ADSC 富集成功。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>ADSC 脂肪向分化
	<ol>
		<li>以 1 × 104 个细胞/cm2 的密度接种第三代 ADSCs。当细胞融合度达到约 90% 时，启动脂肪向诱导。</li>
		<li>使用高糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）配制脂肪向诱导培养基，其中含 10% 胎牛血清（FBS）、0.5 mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）、1 µM 地塞米松、10 µg/mL 胰岛素和 1 µM 罗格列酮。</li>
		<li>诱导 3 天后，更换为维持培养基，并每 2 天更换一次培养液。</li>
		<li>诱导 14 天后，用油红 O 染色，并在倒置显微镜下观察脂滴。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>ADSC 成骨向分化
	<ol>
		<li>当细胞融合度达到 80–90% 时，开始成骨向诱导。使用高糖 DMEM 配制成骨向诱导培养基，其中含 10% FBS、10 mM β-甘油磷酸钠、50 µg/mL 抗坏血酸、10 µM 骨化三醇和 1 µM 地塞米松。</li>
		<li>每 2–3 天更换一次培养基，持续诱导约 14 天。</li>
		<li>用 2% 茜素红 S（pH 5.2）染色，并在倒置显微镜下观察。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>类器官构建与鉴定
	<ol>
		<li>在完全培养基中制备 ADSCs 单细胞悬液，并将细胞浓度调整为 2 × 104 个细胞/20 µL。</li>
		<li>将 100 mm 培养皿的盖子倒置，在其内表面滴加 20 µL 细胞悬液液滴。</li>
		<li>在培养皿底部加入无菌 PBS 以维持湿度，小心盖上盖子，并在标准培养条件下孵育悬滴。</li>
		<li>每日观察液滴，让细胞聚集并形成球体，持续 6 天。</li>
		<li>用移液器轻柔收集球体，并转移至预冷的冰上 Matrigel 中。</li>
		<li>将球体包埋于 Matrigel 中，将混合物接种至培养板，随后在标准培养条件下孵育。</li>
		<li>定期更换培养基，监测类器官生长，直至第 18–28 天，结构变得致密且成熟。</li>
		<li>用 4% 多聚甲醛固定类器官，0.1% Triton X-100 透化，5% BSA 封闭非特异性结合位点。</li>
		<li>将样本与抗 CD73、CD90、CD11b 和 CD45 的一抗孵育，随后与相应的荧光二抗孵育。</li>
		<li>用 Hoechst 和 BODIPY 分别染色细胞核和脂滴，在荧光显微镜下观察染色样本。 
		注意：细胞分选及所有涉及开放培养的操作（包括接种、换液和染色准备）均应在生物安全柜内严格无菌条件下进行。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Escudero, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+generation+of+pre-vascularized+and+functional+human+beige+adipose+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Sci%22%5BJournal%5D)">Scalable generation of pre-vascularized and functional human beige adipose organoids.</a> Adv Sci. 2301499, 1-20 (2023).</li>
<li>Mandl, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+organoid+model+derived+from+human+adipose+stem%2Fprogenitor+cells+to+study+adipose+tissue+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Adipocyte%22%5BJournal%5D)">An organoid model derived from human adipose stem/progenitor cells to study adipose tissue physiology.</a> Adipocyte. 11 (1), 164-174 (2022).</li>
</ol>

作者 Ziyi Zhao 和 Jiaying Yu 隶属于成都多森生物技术有限公司，该公司生产本实验方案中使用的 SoniConvert 系统（SC-L1W）和脂肪组织解离试剂盒（TM008）。其他作者声明无竞争利益。

本研究介绍了一种用于分离脂肪来源细胞（主要是脂肪细胞和脂肪源性干细胞）的新型整合方法，该方法克服了传统方法的关键局限性。通过将组织特异性酶解松解与精密机械波解离相结合，该系统实现了快速（总处理时间约30分钟）、高存活率（80–95%）且可重复的细胞分离。
传统的酶消化法虽然被广泛使用，但依赖长时间的胶原酶孵育（1–3 小时）以及剧烈的机械吹打，这会导致脂肪细胞破裂并释放脂质，引发氧化应激，进而造成细胞活力下降（通常&#60;70%）16,17。相比之下，我们的方法采用双重作用机制：（1）一种短时间孵育（5–15 分钟）的脂肪组织特异性松解试剂，可轻柔破坏细胞外基质交联结构，同时不损伤细胞膜；（2）由微处理器控制的机械波，实现精确且低振幅的组织解离。这种协同作用显著减少了脂质污染和氧化损伤，细胞活力达到80–95%， consistently 超过传统方法10–25%18,<sup class="x...

脂肪来源的干细胞（ADSCs）是间充质干细胞（MSCs）的一个重要亚群，可从脂肪组织中分离获得，因其易于获取、采集过程微创、增殖能力强、具有多向分化潜能以及显著的旁分泌和免疫调节特性而展现出巨大的治疗潜力1,2,3,4。这些特性使ADSCs成为再生医学、组织工程和免疫治疗领域极具前景的候选细胞。然而，ADSCs的转化应用依赖于能否分离出功能完整且高纯度的细胞群体，而这一过程在技术上仍具挑战性。脂肪组织独特的生物学特性带来了两个主要难题：（1）脂肪细胞富含脂质，在机械处理过程中容易破裂，释放出游离脂质，污染基质血管组分（SVF），从而影响细胞活力和得率5,6；（2）该组织结构复杂，包含筋膜、内皮细胞、免疫细胞和血液成分7，增加了脂肪来源细胞分离的难度。这些局限性凸显了迫切需要一种高效、快速且能保持细胞活性的方法，以分离高质量的ADSCs和脂肪细胞——后者在代谢性疾病建模和细胞治疗等下游应用中同样至关重要。
目前已有多种成熟的方法可用于分离脂肪来源的细胞，包括酶消化法、组织块培养法和机械分离法8,9,10。其中应用最广泛的是酶消化法，该方法利用胶原酶降解细胞外基质（ECM）成分，从而释放被包裹的干细胞。该方法通常包括组织剪碎、胶原酶消化（37 °C，1–2 h）、通过离心分离基质血管组分（SVF）以及贴壁培养纯化等步骤。尽管该法在分解ECM方面效果显著，但仍存在明显缺点：处理时间较长（总计3–4 h）、需要较大的样本量，以及动物来源胶原酶可能带来的酶毒性或批次间差异风险，这些因素均限制了其在临床中的转化应用。组织块培养法依赖干细胞从组织碎片中迁移而出，所获得的细胞活力得以较好保持，但存在通量低、细胞回收时间长（7–10天）的问题。机械解离法通过物理破坏（如振荡、剪切）实现细胞分离，虽可缩短处理时间，但常会损害细胞完整性，导致细胞活力下降和细胞群体纯度不足。总体而言，上述方法均难以同时满足效率、纯度和细胞活力这三个临床级细胞分离所必需的关键标准。因此，我们提出一种新型的脂肪来源细胞（脂肪细胞和ADSCs）分离方法，该方法结合了酶消化与机械波介导的解离过程11。该方法实现了两项关键改进：（1）&#160;时间效率高：通过结合预优化的无动物源性酶混合物与低频机械波，将总处理时间从3–4 h缩短至约30 min（图1）；（2）&#160;细胞活力保持良好：温和的机械分散显著减少了脂肪细胞破裂和脂质释放。需要强调的是，30 min的时间指的是核心分离流程（包括消化、机械解离、过滤和初步离心）以获得粗制的脂肪细胞和SVF组分；后续可选的纯化步骤（如红细胞（RBC）裂解）则需额外的操作时间。
我们优化的脂肪细胞分离方法在多个研究和临床领域展现出显著的应用潜力。在基础研究中，所获得的高活力细胞在脂肪向和成骨向分化研究中表现出优异性能，为组织工程应用提供了可靠的细胞来源。在转化医学中，临床研究已证明脂肪间充质干细胞（ADSCs）在治疗骨关节炎12、心血管疾病13、多发性硬化症14以及炎症性肠病（IBD）/克罗恩病15等疾病方面具有治疗潜力。快速分离获得的ADSCs可作为构建脂肪组织类器官和实施细胞治疗的理想基本单元，显著推动药物筛选与疾病建模研究。此外，高质量的单细胞悬液适用于单细胞RNA测序。综上所述，该整合方法为脂肪组织研究建立了一个稳健的技术平台，有力支持再生医学领域的基础研究与临床转化。

<table><tbody><tr><td>A型组织解离试剂盒</td><td>Docsense</td><td>TM001</td><td>包含A型组织解离试剂（A型溶液）和A型组织解离缓冲液（A缓冲液）。</td></tr><tr><td>脂肪细胞分化培养基试剂盒</td><td>OriCell</td><td>GUXMD-90031</td><td>用于脂肪细胞分化，包括高糖Dulbecco改良Eagle培养基（未修饰）和维持培养基</td></tr><tr><td>茜素红S</td><td>OriCell</td><td>A5533ALIR-10001</td><td>用于成骨分化的矿化染色（pH 5.2）</td></tr><tr><td>抗坏血酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4544</td><td>L-抗坏血酸，经细胞培养测试，用于成骨诱导</td></tr><tr><td>巴马小型猪</td><td>成都达硕实验动物有限公司</td><td></td><td>一岁雄性，SPF级动物，按照标准化的疫苗接种、驱虫和清洁程序进行饲养。https://www.cd-dossy.cn/animalpl_detail/12606067609851863&lt;br/&gt; 04.html</td></tr><tr><td>Bio-Rad TC20自动细胞计数仪</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1450011</td><td>用于细胞活力和产量评估的自动细胞计数仪</td></tr><tr><td>BODIPY</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D3922</td><td>中性脂质染料</td></tr><tr><td>BSA（5%）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td>牛血清白蛋白，冻干粉末，用于封闭</td></tr><tr><td>骨化三醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9756</td><td>1&amp;alpha;,25-二羟基维生素D&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;，用于成骨诱导</td></tr><tr><td>细胞筛（70 &amp;mu;m）</td><td>Corning</td><td>352350</td><td>Falcon 70 &amp;mu;m细胞筛，无菌，用于FACS样本制备</td></tr><tr><td>细胞滤器（200 &amp;mu;m）</td><td>pluriSelect</td><td>43-50200-03</td><td>pluriStrainer，PET网孔，适配50 mL离心管，无菌&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>离心管（50 mL）</td><td>Corning</td><td>352098</td><td>Falcon 50 mL高透明度锥形离心管，无菌，聚丙烯材质</td></tr><tr><td>计数载玻片（适用于Bio-Rad TC20）</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1450011</td><td>双室计数载玻片，用于TC20自动细胞计数仪&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>培养皿（100 mm）</td><td>Corning</td><td>430167</td><td>无菌聚苯乙烯培养皿，用于悬滴法类器官形成</td></tr><tr><td>地塞米松</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4902</td><td>&amp;ge;98%，用于脂肪细胞和成骨诱导</td></tr><tr><td>D-Hanks平衡盐溶液或PBS</td><td>Gibco</td><td>10010015</td><td>预冷至4 &amp;deg;C，pH 7.4。</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965084</td><td>用于新鲜分离的SVF培养</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Beyotime</td><td>D7073</td><td>可选，若观察到细胞团块建议使用。</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459836</td><td>75%，用于表面消毒。</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Gibco</td><td>A4736201</td><td>经Tet系统认证，美国来源，无菌&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>流式细胞仪</td><td>BD Biosciences</td><td>BD FACSCanto II</td><td>三激光（405 nm、488 nm、633 nm），8个荧光通道，用于表面标志物分析（CD73、CD90、CD11b、CD45），满足20 psi下70 &lt;img alt=&quot;方程1&quot; src=&quot;/files/ftp_upload/70464/70464eq1.jpg&quot; style=&quot;margin: auto;&quot;/&gt;μm喷嘴要求</td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>Olympus</td><td></td><td>倒置或正置型号，具备FITC和DAPI滤光片组。</td></tr><tr><td>荧光二抗</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11001（抗小鼠）、A-11008（抗兔）</td><td>Alexa Fluor标记，用于免疫荧光染色</td></tr><tr><td>荧光素标记抗体（CD73、CD90、CD11b、CD45）</td><td>BD Biosciences</td><td>561254（CD73）、561970（CD90）、557321（CD11b）、555485（CD45）</td><td>用于ADSC表型的流式细胞分析</td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H3570</td><td>活/死细胞评估用核染料。</td></tr><tr><td>IBMX</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5879</td><td>&amp;ge;99%（HPLC），用于脂肪细胞诱导培养基</td></tr><tr><td>冰冻无菌生理盐水</td><td>Baxter</td><td>2F7124</td><td>0.9%氯化钠注射液，USP，用于组织冲洗</td></tr><tr><td>胰岛素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9278</td><td>重组型，酵母表达，用于脂肪细胞诱导</td></tr><tr><td>碘伏</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>25104</td><td>2%消毒液。</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>生长因子减少型，无酚红，用于类器官包埋&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>金属浴</td><td>Servicebio</td><td>SMB-H</td><td>用于37 &amp;deg;C孵育。</td></tr><tr><td>油红O</td><td>OriCell</td><td>OILR-10001</td><td>用于脂肪细胞分化的脂质染色</td></tr><tr><td>光学显微镜</td><td>Olympus</td><td></td><td>标准明场显微镜，配备10x&amp;ndash;40x物镜。</td></tr><tr><td>成骨分化培养基试剂盒</td><td>OriCell</td><td>GUXMD-90021</td><td>用于成骨分化，包括高糖Dulbecco改良Eagle培养基（未修饰）和维持培养基</td></tr><tr><td>P1000移液器配宽口吸头</td><td>Beckman Coulter</td><td>B01113</td><td>Biomek P1000 Span-8宽口吸头，无菌</td></tr><tr><td>多聚甲醛（4%）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>J61899</td><td>水溶液，用于类器官固定&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>巴斯德吸管</td><td>Corning</td><td>7095S-5C</td><td>无菌，一次性使用。</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco</td><td>15070063</td><td>10,000 U/mL青霉素，10,000 &amp;mu;g/mL链霉素，无菌&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>戊巴比妥钠</td><td>Hikma Pharmaceuticals USA Inc.</td><td>24201-010-20</td><td>注射用，用于安乐死（100 mg/kg体重，静脉注射）。ANDA 203619&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>一抗（CD73、CD90、CD11b、CD45）</td><td>BD Biosciences</td><td>561254（CD73）、561970（CD90）、557321（CD11b）、555485（CD45）</td><td>用于类器官免疫染色</td></tr><tr><td>红细胞裂解缓冲液（RBC Lysis Buffer）</td><td>Solarbio</td><td>R1010</td><td>如后续实验需要时使用。</td></tr><tr><td>冷冻离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5702R</td><td>用于4 &amp;deg;C下的离心步骤。</td></tr><tr><td>罗格列酮</td><td>Cayman Chemical</td><td>71740</td><td>&amp;ge;98%，PPAR&amp;gamma;激动剂，用于脂肪细胞诱导</td></tr><tr><td>锐器盒</td><td>Becton Dickinson</td><td>305270</td><td>防穿刺容器，用于废弃刀片和剪刀</td></tr><tr><td>SoniConvert单细胞悬液制备系统</td><td>Docsense</td><td>SC-L1W</td><td>用于组织的机械解离。</td></tr><tr><td>染色缓冲液（流式染色缓冲液）</td><td>eBioscience（Thermo Fisher Scientific）</td><td>00-4222-57</td><td>200 mL，即用型，含FBS和0.09%叠氮化钠作为防腐剂，用于流式细胞术中的抗体和细胞稀释、表面染色及洗涤步骤&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>无菌1.5 mL Eppendorf管</td><td>Eppendorf</td><td>30121.517</td><td>Safe-Lock微量离心管，无菌，用于组织剪切</td></tr><tr><td>无菌培养皿</td><td>Corning</td><td>430167</td><td>100 mm × 20 mm无菌培养皿，用于组织收集</td></tr><tr><td>无菌镊子</td><td>Sklar</td><td>96-1719</td><td>无菌持针钳，带齿，用于组织操作&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>无菌纱布</td><td>Dukal Corporation</td><td>7060033</td><td>无菌纱布垫，用于消毒和擦拭</td></tr><tr><td>无菌眼科剪</td><td>Sklar</td><td>10023-580</td><td>Vannas型弹簧剪，用于将组织剪切成1-2 mm&amp;sup3;小块</td></tr><tr><td>无菌剃刀</td><td>3M</td><td>9681</td><td>外科准备用剃刀，用于手术区域脱毛</td></tr><tr><td>无菌手术刀</td><td>Integra Miltex</td><td>4-415</td><td>无菌一次性手术刀，用于切口</td></tr><tr><td>无菌手术剪</td><td>Sklar</td><td>10022-580</td><td>Merit无菌虹膜剪，用于解剖血管和结缔组织&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>T25细胞培养瓶</td><td>Corning</td><td>430639</td><td>Falcon T25细胞培养瓶，带透气盖，无菌</td></tr><tr><td>曲拉通X-100（0.1%）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>实验室级，用于细胞通透化&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td>0.4%溶液，用于细胞活力计数。</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA（0.25%）</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td>0.25%胰蛋白酶，1 mM EDTA，用于ADSC消化</td></tr><tr><td>&amp;beta;-甘油磷酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9422</td><td>五水合二钠盐，用于成骨诱导</td></tr></tbody></table>

高效分离猪脂肪组织来源的间充质干细胞和脂肪细胞

Efficient Isolation of Adipose-derived Stem Cells and Adipocytes from Porcine Adipose Tissue

脂肪来源干细胞（ADSCs）因其来源丰富、获取过程微创、具有多向分化潜能以及免疫调节特性，已成为再生医学中理想的种子细胞。其应用涵盖组织修复、疾病建模和细胞治疗等领域；然而，高效分离出高活力的ADSCs仍是推动基础研究和临床转化的关键。传统的分离方法，如酶消化结合移液管机械解离，存在处理时间长（1–3 小时）、细胞活力低（通常&#60;70%）以及批次间差异大等局限性，严重影响后续实验的可靠性。
本文介绍了SoniConvert系统（一种基于机械波的细胞分离系统），该系统结合了机械波与酶消化技术，以应对上述挑战。该系统集成了基于微处理器的控制单元，通过数字反馈调节由机械波介导的组织解离过程，并配合专为脂肪组织优化的组织特异性松解试剂（孵育时间为5–15分钟）。该方法可快速将组织转化为单细胞悬液，机械解离过程仅需3–9秒即可完成。
该系统具有三个优势：（1）超快速处理，核心分离过程——从酶消化到初始细胞组分分离——约在30分钟内完成（&#62;与传统方法相比可减少90%的处理时间）；（2）高细胞活性保持，经台盼蓝染色证实细胞活性达80–95%，优于传统方案；（3）广泛的兼容性，所得单细胞悬液适用于原代细胞培养、流式细胞术、细胞毒性检测及脂肪类器官构建。该系统通过缩短处理时间、增强细胞完整性并减少操作变异性，为脂肪相关研究提供了实用的技术平台。

<img alt="预处理、解离、分离过程；单细胞悬液、酶消化示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70464/70464fig1.jpg" data-altupdatedat="1782187231000" data-alt="图1"> 
图1： 脂肪来源细胞分离过程的示意图。 该图展示了传统方法与当前方法作为示例性工作流程。脂肪来源细胞的分离包括三个主要步骤：第一步是预处理；第二步是解离脂肪组织以释放细胞；最后一步是通过过滤和离心分离细胞。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70464/70464fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
如图1所示，已成...

在此，我们介绍一种高效分离脂肪来源干细胞和脂肪细胞的标准方法，其特征在于 &#62;处理时间减少90%，细胞存活率高，且具有广泛的兼容性。

脂肪来源的干细胞（ADSCs）因其来源丰富、采集过程微创、……而成为再生医学中理想的种子细胞

本研究的目的是高效且快速地从脂肪组织中分离细胞。传统的消化方法耗时较长，且可能导致过度消化。我们采用的酶解与机械波处理方法可实现温和的组织分散，并缩短分离时间。首先，将安乐死后的猪的背部皮下脂肪组织取一小块置于培养皿中。沿脂肪组织与真皮层之间的自然层面进行解剖，以获得完整、厚度为两到三毫米的ULB组织片。用冰冷的无菌生理盐水冲洗ULB一次。撕开无菌培养皿后，将组织置于无菌培养皿中，在预先灭菌的天平上称重。每1.8克组织加入10毫升冰冻的D-Hank's缓冲液，并保持组织完全浸没。使用无菌手术剪识别并切除组织中所有可见的血管。去除任何结缔组织和纤维化成分。将切除的材料丢弃至指定的生物危害容器中。用D-Hank's缓冲液冲洗组织，以去除残留的血液和碎片。撕开培养皿后，将组织置于已预消毒的天平上称重。取1.8克冲洗后的组织碎片转移至无菌的1.5毫升微量离心管中。向管中加入800微升A型组织解离缓冲液。使用无菌眼科剪将管中的组织剪切成约一至二立方毫米大小的碎片。将组织碎块连同周围的缓冲液转移至新的微量离心管中。向管中加入 200 µL A 型组织解离试剂。用手轻轻旋转并摇动试管三次，以混匀内容物。确保脂肪组织碎片完全浸没在解离液中。检查试管盖是否已紧密闭合。将试管放入37摄氏度的金属浴中，孵育5至10分钟。将缓冲液中部分消化的脂肪组织转移至指定用于机械解离系统的无菌1.5毫升微量离心管中。运行脂肪组织的预设程序，使用200赫兹正弦波进行机械解离。收集细胞悬液，通过200微米细胞筛网过滤至新的50毫升离心管中。向筛网中加入5毫升4摄氏度预冷的D-Hank溶液，用D-Hank溶液冲洗筛网两次。将过滤后的细胞悬液在4°C条件下以500 G离心5分钟。使用无菌巴斯德吸管吸除并弃去上清液中的脂质层，同时保留1毫升缓冲液以保护脂肪细胞层。收集含有脂肪细胞的第二层，注意不要扰动第三层和第四层。吸出并弃去第三层。向含有基质血管组分（SVF）的底部沉淀中加入1毫升D-Hank's缓冲液。轻轻重悬细胞沉淀，使细胞浓度达到每毫升2×10⁶至5×10⁶个细胞。在1.5毫升微量离心管中制备SVF细胞悬液。使用前将悬液置于冰上保存。取10微升SVF细胞悬液和10微升0.4%台盼蓝溶液，加入无菌的0.5毫升微量离心管中。轻轻吹打混匀三次。取10 µL染色后的细胞混合液转移至适用于自动细胞计数仪的计数板中。确认样品完全充满计数室，且无溢出。将计数板插入自动细胞计数仪中。选择台盼蓝染色检测类型，并根据需要调整细胞浓度范围。按下“计数”按钮以启动自动细胞计数。监测计数室图像，观察仪器对活细胞和死细胞的自动区分。记录仪器屏幕上显示的细胞活力百分比及活细胞总数。对每个样本进行三次独立测量。计算每克脂肪组织的平均细胞活力和细胞产量。用含有5微克/毫升huksed和1微摩尔BODIPY的D.Hank's溶液配制染色液。将分离的脂肪细胞在染色液中于37摄氏度孵育15分钟。使用自制的脂肪细胞友好型载玻片盖玻片系统，制备适用于荧光显微镜观察的样品。这种自制的脂肪细胞友好型封片系统可实现完整脂肪细胞的均匀分布，从而获得清晰的成像效果。与传统方法产生的拥挤、多层排列不同，所提取的脂肪细胞保持了完整的结构和正常的形态。通过机械解离方法获得的脂肪细胞存活率显著高于传统的酶解水解方法。纯化并培养的脂肪来源干细胞表现出均匀的成纤维细胞样形态，细胞呈细长的梭形，排列有序。大多数细胞未被染色，表明其具有活性，仅有少量细胞被染成蓝色，代表死亡细胞。本方案可使研究人员比较不同脂肪库中分离的细胞特征。通过本方案获得的基质血管组分（SVF）可用于类器官构建和脂肪干细胞纯化。未来的研究可进一步优化分离方法，以考虑不同脂肪库间细胞外基质的脂肪组织差异。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

高效分离猪脂肪组织中脂肪来源的干细胞和脂肪细胞

本视频展示了一种从小鼠主动脉弓周围脂肪组织中分离和培养荧光标记的神经嵴来源脂肪干细胞（ADSCs）的技术。分离后，通过荧光激活细胞分选技术检测并分选NCADSCs，随后将其接种于培养板中进行培养，以促进细胞增殖。...

从小鼠主动脉周围脂肪组织中分离脂肪来源的干细胞

2001年，加州大学洛杉矶分校的研究人员描述了一种从脂肪组织中分离成体干细胞群体的方法，这类细胞被称为脂肪来源干细胞（Adipose-derived Stem...

从人脂肪抽吸物中手动分离脂肪来源干细胞

本方案描述了从猪皮下脂肪组织中分离猪脂肪源性干细胞（pADSC）并检测其多向分化潜能的方法。这种具有多向分化潜能的pADSC可用于阐明脂肪细胞分化过程，并研究其向中胚层间充质或其他外胚层和内胚层谱系细胞的转分化，以用于再生医学研究。...

从猪皮下脂肪组织中分离与分化脂肪源性干细胞

本实验方案描述了通过荧光激活细胞分选或免疫磁珠分离技术，从小鼠腹腔内白色脂肪组织（WAT）储存部位中分离脂肪生成性及纤维炎症性基质细胞亚群的技术方法。...

从小鼠腹腔内脂肪组织库中分离脂肪生成性与纤维-炎症性基质细胞亚群

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从小鼠附睾脂肪组织中分离脂肪前体细胞

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通过水射流技术注射猪脂肪组织来源的基质细胞

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分离大鼠脂肪组织间充质干细胞并诱导其分化为胰岛素生成细胞

分离与鉴定源自Sprague Dawley大鼠脂肪组织的间充质干细胞

本方案描述了从小鼠脂肪组织中半自动化分离基质血管组分（SVF）以获取前脂肪细胞并实现脂肪细胞分化的步骤...

使用组织解离仪半自动化分离小鼠白色脂肪组织中的基质血管组分

我们已确定胎盘是发育过程中的主要造血器官。研究发现，造血干细胞（HSCs）在胎盘内独特的微环境生态位中生成并扩增。本文描述了从小鼠胎盘中分离和可视化造血干细胞所需的实验技术。...

从胎盘中分离和分析造血干细胞

了解利用酶解与机械波联合技术从猪脂肪组织中高效分离脂肪来源干细胞和脂肪细胞的方法。该方案可在30分钟内完成，细胞存活率达80-95%，适用于再生医学研究。

高效分离猪脂肪组织来源的间充质干细胞和脂肪细胞

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