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作者谨此感谢克里斯托弗纽波特大学 TheFishLab 团队的 Rommel Pagkalinawan、Robby Buck、Elizabeth Hiltz、Haley Dewitt、Maia Tankersley、Alexis Thai-Nguyen、Grady Fleming、Jacob Young 和 Jack Medlin，他们在动物饲养以及验证实验的数据收集中作出了贡献。作者还感谢 Samantha Commons 在 2025 年夏季社区负责人项目期间提供的协助，包括对现有高成本装置和低成本装置的所有组件进行清点。作者同时感谢克里斯托弗纽波特大学学生研究与创意活动办公室通过本科生暑期学者项目为 K.K. 提供的资金支持。图 2 由 Kinslow, K. (2025) 使用 BioRender 制作。https://BioRender.com/wbf0wph。

所有实验程序均经克里斯托弗纽波特大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准（方案编号 #2025-23）。
1. 动物
<ol>
	<li>获取成年短鳍野生型斑马鱼23,36,37，也可使用其他品系。或者，获取胚胎并在实验室内自行培育。</li>
	<li>将斑马鱼饲养在独立的10加仑（38 L）水族箱中，饲养密度约为每加仑（3.8 L）水体两条鱼。水族箱应配备活性生物过滤器、气石和浸入式加热器。或者，可将鱼饲养在水生动物饲养架系统中。</li>
	<li>维持水质参数在以下范围内：pH 7.0–8.0，电导率 400–700 µS，温度 25–27 °C，&#60;40 ppm 硝酸盐，&#60;0.2 ppm 亚硝酸盐，以及 0.01–0.1 ppm 氨。</li>
	<li>将动物置于12小时光照：12小时黑暗的光周期条件下，并每天投喂一次商业片状饲料。</li>
	<li>从这些水族箱中随机选取动物用于实验分组。</li>
	<li>实验结束后，可将动物重新用于其他科研或教学用途，或将其浸入250–500 mg/mL缓冲三卡因溶液中30分钟实施安乐死，随后采用物理方法（例如断头）以确保死亡。可利用安乐死后动物进行后续的生物测定和/或神经化学分析。</li>
</ol>
2. 三室开放式水箱自由游泳实验装置与软件
<ol>
	<li>测试室的构建
	<ol>
		<li>小心地从每个5.5加仑水箱的底部拆除塑料边框。使用带有切割轮的旋转工具在角落处切开塑料，以便于拆卸。一旦塑料边框被切开，使用普通油灰刀将塑料与硅胶粘合剂分离。</li>
		<li>为了散射背光，使用白色自粘式货架衬垫覆盖所有三个水箱的背面、其中一个水箱的左端以及另一个水箱的右端。用于中心室的水箱两端应保持裸露。</li>
		<li>使用搪瓷记号笔或黑色图形布局胶带，在每个室前部距顶部边缘下方4.5 cm处标出一条黑色水平线，以指示注水水位。</li>
		<li>将一张偏振滤光片裁剪至合适尺寸，覆盖在两侧相邻水箱裸露的一端侧面。将两张滤光片相互呈90°方向排列。使用透明胶带沿四边固定，防止水渗入水族箱玻璃与滤光材料之间的空隙。 
		注意：偏振滤光片的交错方向可防止一侧相邻刺激室中的实验动物看到另一侧相邻刺激室中的动物（或其他刺激），同时仍能使其看到中心室中的受试动物。中心水箱中的受试动物则可看到两个相邻室中的视觉刺激。</li>
		<li>构建聚氯乙烯（PVC）底座，以精确定位水箱在实验台上的位置。使用厚度为1/4英寸（0.635 cm）的白色PVC板切割底座底部，尺寸为21 cm × 122.5 cm；使用1×2 PVC装饰条切割两端部件，长度为21 cm。</li>
		<li>将三个水箱放置到位后，测试两端部件与底座的配合情况。确保分隔板（见下文）能够轻松插入和取出，并确认两侧水箱不紧贴中心水箱的两侧。测试配合完成后，使用PVC胶水将端部部件与PVC底座粘合固定。</li>
		<li>为每个室制作透明盖板，将聚碳酸酯板切割成三块，尺寸与5.5加仑水箱顶部边缘的外部尺寸相同（40 cm × 21 cm）。在每块盖板边缘周围切割出一个凹槽（6 mm × 4 mm），以便盖板能稳固地放置在室的顶部。</li>
		<li>当动物被安置在室内时，应盖上盖板。在动物各自所在的室内放置一个浸入式加热器和连接水族箱气泵的气石，以实现温度控制和通气。使用三通空气阀平衡三个气石之间的气流。</li>
		<li>通过层压两张A4尺寸的浅色卡纸，制作简单的不透明分隔板，用于放置在中心室与每个相邻室之间，以控制实验动物何时接受社交刺激的视觉暴露。</li>
		<li>为便于悬挂和远程移除分隔板，在每张层压板的一条210 mm长边上，分别在85 mm和125 mm处打两个孔。</li>
		<li>剪下两段75 cm长的高强度细绳，将细绳穿过每个孔，并将剩余两端打结连接，使两张板通过中心轭部相连。</li>
		<li>剪一段6 m长的细绳。将6 m细绳的一端系在轭部，形成中央系留线，将另一端穿过旋转眼滑轮。</li>
		<li>将旋转眼滑轮安装在最中心水箱正上方的天花板上，并确保细绳末端悬挂在实验装置外侧（图1A）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>照明系统的构建
	<ol>
		<li>使用厚度为1/4英寸（0.635 cm）的白色PVC板为面板灯制作框架。切割两块端板（10 cm × 31.5 cm）以及一块顶板和一块底板（10 cm × 122 cm）。测试框架各部件的配合，确保面板灯能嵌入框架内部。测试无误后，使用PVC胶水将框架部件粘合固定。</li>
		<li>由合格电工为面板灯加装三芯电缆。</li>
		<li>由合格电工将滑动调光器接入防水外壳中的输出插座，用于控制面板灯的电源输入。</li>
		<li>调节滑动调光器，将背光亮度调整至350 lux。向室内注水后，调节滑动调光器，使室前部的亮度达到15 lux。 
		注意：研究人员应在实验前、实验中和实验后验证照明条件，确保亮度设置保持稳定。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>帘幕与相机支架的构建
	<ol>
		<li>在实验台上安装面板灯、水箱底座板和三个水箱。竖直设置两根防水布立杆，使其从地面稳固地顶至天花板，且距离水箱前部至少75 cm。</li>
		<li>通过将布料一端折叠60 cm，并在距顶部折叠处6 cm处缝制直线针脚，为每块帘幕制作顶部套管，以便支架部件可滑入其中。</li>
		<li>根据实验区域的宽度和深度测量横连和稳定部件的尺寸。 
		注意：在FishLab当前的设置中，垂直防水布立杆被放置在实验室角落，距后墙146.5 cm。内侧立杆距侧墙6.5 cm，外侧立杆距侧墙142.5 cm。</li>
		<li>将三段电气金属管（EMT）导管各切割为143 cm长，作为支架侧面的稳定部件。将其中一段穿过可移动帘幕的顶部套管，并水平固定在距地面190 cm的高度。</li>
		<li>使用T型夹在一端将该段导管固定在外侧防水布立杆上，另一端使用定制的3D打印插座固定。使用螺丝将3D打印插座固定在后墙上。将另外两段导管固定在内侧防水布立杆上。</li>
		<li>将顶部横杆穿过其中一块固定帘幕的顶部套管，并置于距地面190 cm高度。一端使用T型夹固定在内侧防水布立杆上，另一端使用另一个3D打印插座固定。</li>
		<li>使用螺丝将3D打印插座固定在侧墙上。将最后一段稳定导管置于距地面120 cm高度，并以类似方式连接至其他两段稳定导管。</li>
		<li>将另一段EMT导管切割为127 cm长，作为支架前部的稳定部件。将其穿过第二块固定帘幕的顶部套管，并使用两端的T型夹将其固定在距地面193 cm高度的防水布立杆上。</li>
		<li>将剩余的一段EMT导管切割为145 cm长，作为相机安装横杆。将其水平置于距地面88 cm高度，使相机与水箱中心对齐。将一端插入固定在墙上的3D打印插座中，并使用定制的3D打印十字夹具将相机横杆紧固在防水布立杆上（图1B）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>相机系统的构建
	<ol>
		<li>将一个相机支架夹在相机横杆上，使相机的水平和垂直中心与中心室的相应中心对齐。 
		注意：如果研究人员希望获取用作视觉刺激的活体动物反应的数字视频，可在每个相邻室前方额外安装相机。最简单的配置是仅放置一台相机，用于拍摄中心实验室的视频。若刺激室中使用活体社交刺激，研究人员也可能希望同时记录这些室的视频。</li>
		<li>将每台相机安装在对应相机支架的螺纹柱上。调整每台相机，使其图像中心对准相应室的观察区域。</li>
		<li>使用绑带或扎带将每台相机的USB线缆固定在相机横杆上，防止线缆垂挂导致相机错位。</li>
		<li>将一段金属网架切割为140 cm长，并垂直安装在支架前部外侧，以防止相机被碰撞移位。使用连接在防水布立杆上的T型夹固定“相机防护笼”。 
		注意：可在支架内侧再安装一个相机防护笼，以进一步防止相机移位；若相机前方被“笼住”，可能需要移除一小段金属网格，以避免遮挡水箱图像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>加载并配置采集软件——OBS（Open Broadcaster Studio）
	<ol>
		<li>下载OBS并安装在运行Windows系统的本地计算机上。启动OBS Studio，并运行自动配置向导，以根据具体的录制需求、硬件资源和网络条件优化设置。 
		注意：该工具位于工具 &#62; 自动配置向导菜单下。</li>
		<li>在配置相机前，验证基本设置。将基础（画布）分辨率设置为与显示器分辨率一致，将输出（缩放后）分辨率设置为录制分辨率（例如720像素）。</li>
		<li>通过右键点击场景框（或使用底部的加号）创建一个场景。为场景命名，并使用该场景定义视频流布局。</li>
		<li>通过右键点击来源框（或使用底部的加号）添加新来源。选择视频捕获设备以添加网络摄像头。为每台相机分配唯一名称（例如“camera-left”、“camera-center”、“camera-right”）。根据需要重复此过程以添加更多相机或其他来源。</li>
		<li>在预览窗口中调整来源的位置和大小。确保相机可见，方法是确认其在来源列表中位于其他来源之上。要将相机视图居中于画布，可在来源列表中选中该来源（出现红色边框），然后按下CTRL+D（居中显示）。</li>
		<li>如需将来源填满整个屏幕，可按下CTRL+F（适应屏幕）或CTRL+S（拉伸至屏幕）。如需裁剪来源，可在拖动边框时按住Alt键。通过观察边缘是否变为绿色来确认裁剪效果。</li>
		<li>通过在来源列表中双击所选相机并选择配置视频，调整亮度、对比度等视频属性。使用属性菜单修改相关设置。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 行为学测试
<ol>
	<li>适应期
	<ol>
		<li>将所有3个实验腔室注满饲养水箱中的水。在每个腔室之间放置不透明隔板，并在整个适应期间保持隔板位置不变。将一只实验对象转移至中央实验腔室，使其适应环境至少1小时后再开始测试。 
		注意：本研究代表性结果所采用的适应期为3小时。适应期对于动物从短暂的转移应激中恢复，并在行为测试前适应实验腔室环境至关重要。</li>
		<li>在适应期开始时，将社会性刺激物放置于两侧的刺激腔室内。将人工社会性刺激物置于左侧刺激腔室中央，同时将一小群4条鱼（2条雄鱼和2条雌鱼，体型、年龄相近且彼此熟悉）转移至右侧刺激腔室。 
		注意：在本实验方案中，人工社会性刺激物与活体社会性刺激物的位置是固定的，未进行交叉平衡，因为先前的研究33,34使用OTFST（开放式三腔选择测试）未检测到刺激物位置对结果的影响。在此情况下进行交叉平衡将不必要地使实验所用动物数量翻倍，违背动物实验的“3R”原则。本方案允许灵活选择待测试刺激物的类型，例如静态模型、同域物种或新物种等。</li>
		<li>在适应期间，为所有含有活体动物的腔室配备一个设定为26 °C的浸入式加热器、一个连接水族箱气泵的气石以及一个水箱盖，以维持稳定的饲养条件。在开始实验前，移除加热器和气石。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>实验测试
	<ol>
		<li>确认两侧刺激腔室中社会性刺激物以及中央腔室中实验对象的活动状态。使用中央腔室的单个摄像头对每位实验对象进行视频录制。 
		注意：本方案中的代表性结果是对Velkey等人33研究中单一条件的重复，用于测试斑马鱼对低保真度（可移动模型）与高保真度（活体鱼群）社会性刺激物的偏好。</li>
		<li>打开OBS Studio以开始录制会话。通过点击并拖动视频窗口的角落，调整中央摄像头画面以充满整个屏幕。在屏幕右下角的Controls（控制）选项下选择Start Recording（开始录制）。</li>
		<li>录制开始后，立即通过滑轮-绳索系统移除不透明隔板。持续录制10分钟，允许实验对象在中央实验腔室内自由移动的同时，同时接触两种社会性刺激物。</li>
		<li>在Controls（控制）选项下选择Stop Recording（停止录制）以结束会话。通过点击屏幕左上角菜单中的File（文件），并在下拉菜单中选择Show Recordings（显示录制文件）来访问已录制的视频。 
		注意：所获得的视频数据为非结构化数据，适用于多种分析方法。</li>
		<li>将活鱼转移回饲养水箱，排空三个腔室中的水，用清水彻底冲洗（注意避免水进入偏振膜之间），每个腔室喷洒5%柠檬酸进行消毒，静置过夜自然风干，并在下一个实验日开始前再次冲洗，然后放回实验台备用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 获取用于分析的结构化数据
<ol>
	<li>选择一种运动分析软件应用（例如 DeepLabCut；参见 https://www.mackenziemathislab.org/deeplabcut）。按照 https://deeplabcut.github.io/DeepLabCut/docs/installation.html 上的用户指南在计算机上安装 DeepLabCut。如果未使用 DeepLabCut，请参考所选软件的相关信息和用户指南以获取进一步指导。</li>
	<li>将四到五个视频加载至 DeepLabCut 用于模型训练，并从每个视频中提取 20–30 帧。定义至少三个主要追踪点（例如头部、躯干、尾部），并训练网络在各帧中追踪这些点。 
	注：欲了解更多信息，请查阅 DeepLabCut 用户指南 https://deeplabcut.github.io/DeepLabCut/docs/standardDeepLabCut_UserGuide.html。代表性结果使用了来自五个视频的 22 个标注帧，包含 3 个追踪点。</li>
	<li>采用基于 ResNet-101 的神经网络训练模型。确定完成训练所需的迭代次数（建议在 100,000 至 200,000 次之间）。确定一个介于 0.5 到 1 之间的 p-截止值。 
	注：在代表性结果中，模型训练使用了 150,000 次迭代，p-截止值为 0.7。如果训练后的网络低于 0.7 的 p-截止值，可通过提高视频对比度或更改标注规范来解决此问题。</li>
	<li>将完全训练好的 DeepLabCut 模型应用于其余实验视频。提取每次试验的位置数据。请参考用户指南 https://deeplabcut.github.io/DeepLabCut/docs/beginner-guides/Training-Evaluation.html。 
	注：在代表性结果中，我们使用 2 次洗牌进行验证，确定测试误差为 2 像素：训练误差为 4 像素（图像尺寸为 1600 × 820 像素）。随后使用该网络分析当前实验装置获取的实验视频。</li>
	<li>使用编程软件（如 Python）定义并分析在三个等宽垂直区域内的运动，以量化偏好。通过识别区域内至少两个身体点来测量区域停留时间，以减少追踪噪声。使用公式：区域总时间 =（区域内的总帧数）/（总帧数）。</li>
	<li>若需测量趋壁性，可将距离水族箱壁一个斑马鱼体长的范围定义为区域，以评估受试对象被动停留在垂直边界附近的倾向。该指标适用于相对较大的实验水族箱。</li>
	<li>使用相同的编程软件定义并测量静止时间（例如冻结行为）。将运动阈值设定为每帧 2–5 像素，并要求连续帧数不少于 15 帧。 
	注：在代表性结果中，冻结行为被定义为连续 15 帧中每帧移动不超过 3 像素。</li>
	<li>汇总并导出各项测量数据，用于统计分析和可视化。 
	注：有关数据分析，请参见 https://github.com/farhanaugustine/DeepLabCut-Analysis-Jupyter-Scripts。我们</li>
</ol>

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<li>Gerlai, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Misbehaving+fish%3A+the+role+of+these+simple+vertebrates+in+the+analysis+of+human+brain+function+and+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Misbehaving fish: the role of these simple vertebrates in the analysis of human brain function and dysfunction.</a> Brain Res. 1863, 149795(2025).</li>
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<li>Velkey, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+%28Danio+rerio%29+prefer+undisturbed+shoals+over+shoals+exposed+to+the+synthetic+alarm+substance+hypoxanthine-3N-oxide+%28C5H4N4O2%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish (Danio rerio) prefer undisturbed shoals over shoals exposed to the synthetic alarm substance hypoxanthine-3N-oxide (C5H4N4O2).</a> Biology. 14 (3), 233(2025).</li>
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<li>Rodriguez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ToxTrac%3A+a+fast+and+robust+software+for+tracking+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Ecol+Evol%22%5BJournal%5D)">ToxTrac: a fast and robust software for tracking organisms.</a> Methods Ecol Evol. 9 (3), 460-464 (2018).</li>
<li>Pereira, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLEAP%3A+a+deep+learning+system+for+multi-animal+pose+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">SLEAP: a deep learning system for multi-animal pose tracking.</a> Nat Methods. 19 (4), 486-495 (2022).</li>
<li>Mathis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DeepLabCut%3A+markerless+pose+estimation+of+user-defined+body+parts+with+deep+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">DeepLabCut: markerless pose estimation of user-defined body parts with deep learning.</a> Nat Neurosci. 21 (9), 1281-1289 (2018).</li>
<li>Gerlai, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Social+behavior+of+zebrafish%3A+from+synthetic+images+to+biological+mechanisms+of+shoaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Social behavior of zebrafish: from synthetic images to biological mechanisms of shoaling.</a> J Neurosci Methods. 234, 59-65 (2014).</li>
<li>Collar, D. C., Thompson, J. S., Ralston, T. C., Hobbs, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast-start+escape+performance+across+temperature+and+salinity+gradients+in+mummichog+Fundulus+heteroclitus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Fish+Biol%22%5BJournal%5D)">Fast-start escape performance across temperature and salinity gradients in mummichog Fundulus heteroclitus.</a> J Fish Biol. 96 (3), 755-767 (2020).</li>
<li>Collar, D. C., Hobbs, T. J., Thompson, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaling+of+fast-start+performance+and+its+thermal+dependence+in+mummichog+Fundulus+heteroclitus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Fish+Biol%22%5BJournal%5D)">Scaling of fast-start performance and its thermal dependence in mummichog Fundulus heteroclitus.</a> J Fish Biol. 104 (3), 611-623 (2024).</li>
<li>Collar, D. C., Stanley, K. L., Thompson, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast-start+performance+and+its+dependence+on+temperature+and+salinity+in+sheepshead+minnow+%28Cyprinodon+variegatus%29%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Biol+Fishes%22%5BJournal%5D)">Fast-start performance and its dependence on temperature and salinity in sheepshead minnow (Cyprinodon variegatus).</a> Environ Biol Fishes. 108 (10), 1515-1530 (2025).</li>
</ol>

作者声明不存在利益冲突。资助方在研究设计、数据收集、分析或解释、论文撰写，以及决定是否发表研究结果等方面均未发挥作用。

本方案表明，当前这种低成本改造的三室开放式场测试装置（3-Chamber OTFST）能够可靠地通过个体在特定区域停留的时间来表征成年斑马鱼的社会偏好行为。利用低成本的构建材料、USB连接的网络摄像头以及开源的视频采集与分析软件，本系统成功重现了斑马鱼更偏好真实活体同种鱼群而非低仿真移动模型的经典发现。这些结果验证了低成本三室OTFST模型在研究鱼类视觉介导社会偏好方面的有效性。在本方案实施过程中，必须在中央测试室两侧壁上安装偏振薄膜，以确保只有实验个体能够看到两侧相邻测试室中的视觉刺激，同时防止活体刺激鱼看到对侧测试室中的视觉刺激。同样，必须通过PVC框架将测试室固定到位，以保证各次实验间视频构图的一致性。为保持光照恒定，在测试装置后方设置了LED背光源，并校准至照度均匀的15 lux。为确保视频采集正常进行，摄像头应正对中央测试室放置，使水箱正面完全充满视频画面。为尽量减少摄像头位置的扰动，需将摄像头牢固地旋紧在支架上，并将USB线缆固定在安装杆上。为进一步降低干扰风险，可在摄像头外部或安装框架上加装摄像头防护笼，防止摄像头因碰撞而偏离对准位置。
本方案的一个显著优势在于整合了...

社会偏好是指个体对社交刺激的接近、寻求或回避倾向，是社会行为的一个基本方面，在包括人类在内的动物群体中对建立联系和等级关系起着关键作用1,2,3,4。理解社会偏好对于揭示社会互动背后的神经和行为机制至关重要。先前的研究表明，社会偏好的缺陷可能与神经发育障碍和精神疾病相关5,6,7,8。动物模型有助于揭示社会行为的生物学基础，并促进用于诊断和治疗社交障碍的转化工具的开发。这些动物模型从啮齿类动物9,10到水生物种11,12，为相关研究提供了有用的框架。
由于啮齿类动物在生理学上与人类具有相似性14，15，自19世纪早期起便被首次用于行为学研究13。尽管最初的研究集中于攻击性等行为，但对社会偏好行为的系统性测量仍较为有限。为填补这一空白，Nadler 等人开发了三室社会偏好实验任务16。该装置由三个相互连通的实验腔室组成。通常，一侧腔室中放置一只新的同种动物，而另一侧腔室则保持空置。实验动物可自由探索所有腔室，记录其在各腔室中停留的时间，并以此作为社会偏好的评估指标。该装置及其操作流程，以及多种变体形式，已获得广泛应用，被用于研究社会行为表现的多个方面17，18，19，以及自闭症谱系障碍啮齿类模型中的社会功能缺陷5，20，21。然而，啮齿类动物研究成本较高，且需要较大的空间。因此，许多研究人员转而采用水生物种开展神经行为学研究。
水生物种中最突出的是斑马鱼（Danio rerio），其具有复杂的行为谱系，包括复杂的社会互动22。由于其在生物医学研究中的实用价值以及社会互动在其行为生态学中的重要性，斑马鱼为研究社会反应提供了一个有意义的框架，可用于与人类进行比较23。斑马鱼在行为神经科学研究中日益流行，因其饲养成本低廉且所需空间相对较小，使其成为大规模研究社会行为和社会偏好的经济且实用的模型24。在一些研究中，采用相邻水箱构型来研究水生物种的社会互动25,26；然而，这种设置在评估社会偏好时通量有限，因为仅呈现一种刺激。这一局限性在2018年通过将小鼠三室实验任务改进应用于斑马鱼得以解决27。改进后的三室开放式自由游泳任务（OTFST）装置由一个丙烯酰胺水箱组成，通过固定的丙烯酰胺隔板分为一个中性起始区和两个侧室，每个侧室分别容纳一条熟悉的或陌生的同种个体。为测量社会偏好，记录个体在每个侧室附近停留的累计时间，结果表明乙醇暴露和sam2基因敲除会降低斑马鱼对新奇刺激的偏好27。尽管啮齿类动物的三室社会互动测试允许受试个体与测试同种个体通过视觉、化学、触觉和听觉等多种模式进行复杂的多模态互动，但水生三室OTFST中使用独立隔室的方式将受试个体与刺激动物之间的互动限制在仅视觉模态。虽然这种单模态互动在生态效度上可能较低，但它为实验提供了更强的控制性，并提高了本科生研究人员开展项目时的操作简便性。在现有文献中，已有不同研究者探索了三室OTFST的多种改进形式，以研究影响斑马鱼社会行为的遗传和环境因素28,29,30,31,32。
当前对三室开放式场测试装置（3-chamber OTFST）的改进设计旨在提供一种多功能且适合本科生使用的模型设备。FishLab 是一个完全由本科生参与的实验室，创建并应用了该装置，并已证明其作为高通量工具在研究斑马鱼社会偏好的有效性。利用该装置开展的研究探索了斑马鱼社会偏好在多种自变量操控下的不同方面。第一项研究证明斑马鱼能够区分真实活体与模拟的社会刺激33，第二项研究考察了斑马鱼对已建立群体与新形成群体的偏好差异34，最近的一项研究则检验了斑马鱼区分化学警戒信号存在与否的群体的能力35。这些研究共同探讨了社会行为的不同方面，包括刺激的真实性、熟悉度以及威胁识别能力，同时揭示了群集偏好的共性，并评估了对捕食风险的反应。然而，前述研究中使用的装置采用了安装在专业摄像支架上的数字IP摄像头、专用的水生动物饲养架系统，以及专有的视频采集与分析软件，总成本可能对预算有限的研究人员或教师而言过高。随着开源软件和高质量USB网络摄像头的出现，现在研究人员可以构建一种低成本版本，适用于指导本科生开展此类技术研究，其总成本（约2,000美元，不含计算机）远低于高成本系统（约20,000美元以上，不含计算机）。
以下方案概述了斑马鱼三室社交测试装置（3-chamber OTFST）低成本版本的开发与应用。由于其成本低廉、操作简便且用途广泛，该装置对于经费有限的小型实验室或教学环境而言是一种实用的工具。当与低成本的饲养环境（如常见的10加仑水族箱）结合使用时，当前系统的部署和维护成本显著降低。此外，使用开放获取软件（如开放广播系统OBS）记录实验过程，以及多种追踪分析软件（例如DeepLabCut、SLEAP等），为捕获斑马鱼社交行为的视频并生成时间序列数据提供了一个低成本且易于获取的技术框架。

<table><tbody><tr><td>10加仑水族箱</td><td>Aqueon, Inc. Franklin, WI, 美国</td><td>#100110010</td><td>在当地宠物用品店购买（1 到 4）</td></tr><tr><td>12 个 1 英寸 T 型管夹</td><td>JoyHua 贸易公司，中国</td><td>ASIN #B0DF19DJF1</td><td>从 Amazon.com 购买（1）</td></tr><tr><td>双联电盒</td><td>Sigma Engineered Solutions，美国北卡罗来纳州罗利</td><td># 14350</td><td>在当地五金店购买（1）</td></tr><tr><td>3/4&quot; 银色金属电气导管（EMT）— 10英尺</td><td>Wheatland Tube, Inc.，美国宾夕法尼亚州惠特兰&amp;nbsp;</td><td>#0550110000</td><td>在当地五金店购买（3）</td></tr><tr><td>三芯电缆</td><td>Utilitech, Inc.，美国北卡罗来纳州夏洛特</td><td>UT010710</td><td>在当地五金店购买（1）</td></tr><tr><td>三孔插座</td><td>伊顿公司，比奇伍德，俄亥俄州，美国</td><td>#270W-SP-LW</td><td>在当地五金店购买（1）</td></tr><tr><td>三通空气阀</td><td>Penn-Plax, Inc. 35 Marcus Blvd. Hauppauge, NY, 美国</td><td>模型 VN3</td><td>在当地宠物用品店购买（1）</td></tr><tr><td>A4 卡纸（白色），覆膜</td><td>有所不同</td><td>有所不同</td><td>从校园书店购买（2）</td></tr><tr><td>活性生物过滤器 Penguin 100</td><td>Spectrum Brands Pet, LLC，美国弗吉尼亚州布莱克斯堡</td><td>#PF00100B</td><td>在当地宠物用品店购买（1至4）</td></tr><tr><td>气石</td><td>Penn-Plax, Inc. 35 Marcus Blvd. Hauppauge, NY, 美国</td><td>AS6Q 型号</td><td>在当地宠物用品店购买（3）</td></tr><tr><td>水族箱通气管</td><td>Penn-Plax, Inc. 35 Marcus Blvd. Hauppauge, NY, 美国</td><td>模型 STD8</td><td>在当地宠物用品店购买（1）</td></tr><tr><td>黑色织物双人床单（167.6 厘米 × 243.8 厘米）</td><td>Royale Linens, Inc.，美国纽约州梅尔维尔</td><td>#00011342258875</td><td>从亚马逊网站（Amazon.com）购买（3）</td></tr><tr><td>Brio 4k 网络摄像头</td><td>罗技国际股份有限公司，瑞士洛桑</td><td>960-001419</td><td>从 Amazon.com 购买（1 至 3）</td></tr><tr><td>计算机（足以运行 Open Broadcaster Studio） &amp;& 1-3 个网络摄像头</td><td>Dell, Inc.，美国德克萨斯州圆石市</td><td>OptiPlex Micro 7010</td><td>从 dell.com 购买（1）</td></tr><tr><td>可调光发光二极管（LED）平板灯</td><td>Lithonia Lighting-Acuity Brands, Inc.，美国佐治亚州康耶斯</td><td>CTCL-153P-WH</td><td>从 Amazon.com 购买（1）</td></tr><tr><td>E-Z Up 防尘隔离杆（2 件装）</td><td>Trimaco, Inc.，美国北卡罗来纳州凯里</td><td># 00047034547330</td><td>从亚马逊网站（Amazon.com）购买（1）</td></tr><tr><td>脚部固定装置 硬件 细绳</td><td>有所不同</td><td>不固定</td><td>在当地五金店购买（1）</td></tr><tr><td>线性偏振滤光片</td><td>B&amp;amp;H Foto &amp;安普&电子公司，美国纽约州纽约市</td><td>Rosco #7300</td><td>在线购买（7）</td></tr><tr><td>Open Broadcaster Software</td><td>OBS 项目</td><td>v32.0.0</td><td>从 https://obsproject.com 下载 (1)</td></tr><tr><td>聚碳酸酯板（0.38&quot;/9.6毫米厚）</td><td>Spectraglass有限公司，苏格兰珀斯</td><td>UPC 编码 # 608037376817</td><td>从 Amazon.com 购买（1）</td></tr><tr><td>聚氯乙烯（PVC）胶粘剂，4盎司罐装</td><td>美国伊利诺伊州芝加哥市 AZEK 公司</td><td>#ARAD0004OZ</td><td>在当地五金店购买（1）</td></tr><tr><td>无边框5.5加仑水族箱</td><td>Aqueon, Inc. 富兰克林，威斯康星州，美国</td><td>#100541424</td><td>在当地宠物用品店购买（3）</td></tr><tr><td>自粘性白色塑料薄膜&amp;nbsp;</td><td>CON-TACT 品牌，美国加利福尼亚州拉米兰达</td><td>#16F-C9A952-06</td><td>在当地五金店购买（1）</td></tr><tr><td>滑动调光开关</td><td>Lutron, Inc.，美国宾夕法尼亚州库珀斯堡</td><td>#LECL-150H-WH</td><td>在当地五金店购买（1）</td></tr><tr><td>小滑轮</td><td>有所不同</td><td>不固定</td><td>在当地五金店购买（1）</td></tr><tr><td>可浸入式50 W加热器（预设为26°C）</td><td>Aqueon, Inc. 富兰克林，威斯康星州，美国</td><td>#100106251</td><td>在当地宠物用品店购买（3 到 7）</td></tr><tr><td>超级夹具相机支架</td><td>中国锦水</td><td>X0040GEYLR</td><td>从 Amazon.com 购买（1 至 3）</td></tr><tr><td>Tetra Whisper 10 水族箱气泵</td><td>Spectrum 宠物，家庭 &amp;amp; Garden, Inc.，美国威斯康星州米德尔顿</td><td>UPC #046798778516</td><td>在当地宠物用品店购买（1）</td></tr><tr><td>防风雨双联电气箱</td><td>Hubbell 公司，美国康涅狄格州谢尔顿</td><td>#MM2420C</td><td>在当地五金店购买（1）</td></tr><tr><td>白色PVC板 1/4&quot; × 24&quot; 48&quot;</td><td>Royal Building Products，布里斯托尔，田纳西州，美国</td><td>#3101</td><td>在当地五金店购买（2）</td></tr><tr><td>白色PVC装饰板，标称尺寸1 x 2（0.75&quot; x 1/5&quot; × 96&quot;)</td><td>Royal Building Products，美国田纳西州布里斯托</td><td>#7832-8</td><td>在当地五金店购买（1）</td></tr></tbody></table>

使用三室开放式自由游动实验检测斑马鱼（danio rerio）社会偏好行为的低成本替代方法

Low-Cost Alternative for Examining Social Preference in Zebrafish (Danio rerio) Using the 3-Chamber Open-Tank Free-Swim Task

理解社会行为是神经行为学研究的核心目标之一，通常通过社会偏好任务进行研究。这些任务最初为啮齿类动物设计，随后被改进用于斑马鱼，广泛用于研究社会动态和行为反应。三室开放式自由游泳任务（OTFST）包括一个中央实验箱，两侧各有一个刺激箱，上方设有摄像头，用于记录中央箱中实验个体的行为，同时使用偏振膜和背光照明以提高视频质量和有效性。本方案采用低成本装置，使用USB网络摄像头和易于获取的材料。我们重点介绍了DeepLabCut的应用，这是一种开源的无标记姿态估计算法工具，可精确追踪动物运动视频，并提供位置时间序列数据，用于多种指标的分析。预实验验证了该系统捕捉稳定社会偏好行为的能力。这种经济型方法为研究斑马鱼社会互动的实验室提供了一个易于实施且可扩展的平台，而三室OTFST的灵活性和相对简便性也使其适用于本科生教学实验室和科研项目。

为了验证上述低成本方法，采用 Velkey 等人实验中的一项条件33 使用当前低成本装置重复了该实验。向受试者（N = 23，男性11名，女性12名）呈现左侧的人工移动模型（低保真度）社交刺激和右侧的真实鱼群（高保真度）社交刺激（图2）；如先前的研究所示33,34 未使用OTFST检测到刺激位置的任何效应或交互作用，人工社交刺激和真实社交刺激的位置是固定的，未进行平衡。采用样本技术获取的数字视频通过DeepLabCut进行特征分析，以每秒30帧的频率提供每个受试者在测试过程中运动的位置时间序列数据补充文件 1）。实验中将中心实验区域的视频画面均分为三个等大的垂直区域（左侧移动区、中央区和右侧活体鱼群区），并使用Python代码对这些区域进行后续分析。分析结果提供了每条鱼在各区域内所停留时间占整个实验时长的百分比，以及在各区域内静止不动的时间占整个实验时长的百分比（像素移动少于3个像...

多室社交偏好实验已从啮齿类动物改良应用于斑马鱼，有助于在模式生物中研究社交行为。本方案验证了一种低成本的三室开放式水箱实验方法，利用网络摄像头和开源软件测量斑马鱼的社交偏好，使其更适用于本科生科研与教学。

使用三室开放式自由游动实验检测斑马鱼（Danio rerio）社会偏好行为的低成本替代方法

理解社会行为是神经行为学研究的核心目标之一，通常通过社会偏好任务进行研究。这些任务最初……

本方案验证了一种低成本、开源的三室开放式水箱自由游泳实验，用于研究斑马鱼的社会偏好行为。该方案可适用于多种物种，并允许本科生研究人员在资源有限的条件下开展社会偏好研究。首先，准备一个包含中央实验区和两侧刺激区的开放式水箱装置。安装背光系统。使用不透明隔板和偏振滤光片以优化视觉隔离和视频对比度。使用相机支撑架将相机安装并校准在腔室前方。拉上遮光窗帘，并在开始实验前保持稳定的环境条件。下载 Open Broadcaster 软件并将其安装在运行 Windows 操作系统的本地计算机上。启动软件后，运行自动配置向导，以根据特定的录制需求、硬件资源和网络条件优化设置。在配置摄像头之前，验证基本设置。将基础画布分辨率设置为与显示分辨率相匹配，并设置适当的输出缩放分辨率。然后，通过在场景框中右键单击并选择“添加场景”来创建一个场景。为场景指定一个名称，并使用该名称定义视频流布局。添加新的源，选择“视频采集设备”以添加网络摄像头。为每个摄像头分配一个唯一的名称，例如 Camera Center，并对其他摄像头重复此过程。在预览窗口中调整源的位置和大小。确保摄像头列于源列表中。按住 Control 键并按下 D 键，将摄像画面移至画布中央。按住 Control 键并按下 F 键以适应屏幕，或按住 Control 键并按下 S 键拉伸画面。按住 Alt 键的同时拖动边界框，以裁剪源画面。接下来，双击选中的摄像头，然后点击“配置视频”。在属性菜单中调整视频的亮度和对比度。从养殖箱中向三个腔室注满水，并在引入鱼类前调节水温。在整个适应期间，确保各 chamber 之间的不透明屏障已放置到位。将一条成年斑马鱼（Danio rerio）转移至中央 chamber，并使其适应至少一小时。将人工社交刺激物放置在左侧相邻的刺激 chamber 中。然后，将由两条大小、年龄和熟悉程度相似的雄鱼和雌鱼组成的小群体（共四条鱼）转移至右侧刺激室。在适应期间，为所有含有活体动物的室提供设定在26摄氏度的浸入式加热器、连接水族箱气泵的气石以及水箱盖，以维持稳定的饲养条件。在开始实验前，移除加热器和气石。启动中央水箱的单个摄像头。运行软件，通过点击并拖动视频角落将中央摄像头画面调整至全屏显示。然后，在控制选项中选择“开始录制”。立即移除不透明屏障。10分钟后，通过在控制选项中选择“停止录制”来结束会话。通过点击左上角菜单中的“文件”，并在下拉菜单中选择“显示录制内容”，即可访问已录制的会话。将四到五个视频载入运动分析软件应用程序（例如 DeepLabCut），并从每个视频中提取 20 至 30 帧。定义至少三个主要追踪点，例如头部、尾部和躯干。训练网络以在各帧中追踪这些点。使用基于 ResNet-101 的神经网络训练模型。确定完成训练所需的迭代次数。随后，将完全训练好的 DeepLabCut 模型应用于其余实验视频，并按照用户指南提取每次试验的位置数据。然后，使用 Python 等编程软件定义并分析在三个等宽垂直区域中的运动，以量化偏好。通过识别区域内至少两个身体点来测量每个区域中的停留时间，以减少追踪噪声。通过将区域内的总帧数除以总帧数，计算每个区域中的总时间。使用相同的编码软件来定义和测量静止不动的时间，例如僵直状态。将运动阈值设定为每帧2到5个像素，且连续帧数至少为15帧。最后，汇总并导出测量结果，用于统计分析和可视化。受试者在靠近活鱼群的右侧区域所花费的会话时间显著多于中间区域或靠近人工移动刺激物的左侧区域。在中间区域与左侧区域之间所花费时间的差异无统计学意义。受试者在中间区域保持静止的时间显著少于在靠近活鱼群的右侧区域或靠近移动刺激物的左侧区域。本方案可供研究人员探究斑马鱼对两种不同社会性刺激的视觉互动倾向，并确定其对哪种刺激具有偏好。研究人员可采用不同物种或刺激组合方式，也可探究其他行为反应，例如快速冲刺或不规则游动。该系统为研究社会功能的转化模型提供了平台，还可用于探索药物学和环境因素的干预效应。

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