Transplantation von aus Stammzellen gewonnenen neuronalen Vorläuferzellen in humane kortikale Schnitte

Beginnen Sie mit einer adhärenten Kultur von aus Stammzellen gewonnenen neuronalen Vorläuferzellen, die für die Differenzierung in kortikale Neuronen vorbereitet sind.

Entfernen Sie das Medium und fügen Sie dann ein Enzym hinzu, um die extrazelluläre Matrix zu stören und die Zellen abzulösen.

Verwenden Sie einen Inhibitor, um das Enzym zu neutralisieren, und fügen Sie dann ein frisches Medium hinzu.

Übertragen Sie die Suspension in ein Röhrchen, zentrifugieren Sie sie und entsorgen Sie den Überstand, um die Zellen zu isolieren.

Resuspendieren Sie die Zellen in einer Basalmembranmatrix, um die Transplantation in das Hirngewebe zu erleichtern, und laden Sie sie dann in ein kaltes Kapillarröhrchen.

Nehmen Sie eine menschliche kortikale Scheibe auf eine Transwell-Anordnung, die ein Medium enthält.

Entfernen Sie einen Teil des Mediums und injizieren Sie dann Tröpfchen der Zellsuspension in das Gewebe.

Inkubieren, damit sich die Matrix verfestigen kann.

Fügen Sie ein Medium hinzu, um das Gewebe einzutauchen, und inkubieren Sie dann, damit sich Vorläuferzellen in Neuronen differenzieren, ihre Neuriten erweitern und Synapsen mit kortikalen Neuronen des Wirts bilden können.

Der kortikale Schnitt ist nun bereit für die Analyse.

Entfernen Sie das Medium aus dem Zellkulturkolben. Am siebten Tag der Differenzierung lösen Sie kortikal geprimte GFP-lt-NES-Zellen ab, indem Sie 500 Mikroliter Trypsin hinzufügen und 5 bis 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.

Als nächstes fügen Sie ein gleiches Volumen des Trypsin-Inhibitors hinzu, gefolgt von fünf Millilitern DDM-Medium. Die Zellen werden resuspendiert, die Zellsuspension vorsichtig in ein 15-Milliliter-Röhrchen überführt und fünf Minuten lang bei 300 g zentrifugiert. Übertragen Sie in der Zwischenzeit die Platte mit dem menschlichen Gewebe aus dem Inkubator in die Haube und entfernen Sie zwei Milliliter des Mediums von der Oberseite des Einsatzes. Entfernen Sie am Ende der Zentrifugation den Überstand, resuspendieren Sie die Zellen in einer kalten, reinen Basalmembranmatrix und überführen Sie die Suspension in ein kleineres Röhrchen.

Sammeln Sie die Zellsuspension in einer kalten Glaskapillare, die zum Absaugen mit einem Gummisauger verbunden ist. Injizieren Sie die Zellsuspension in winzigen Tropfen, indem Sie die halbtrockene Gewebescheibe an verschiedenen Stellen einstechen. Lassen Sie das Gel 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius erstarren.

Übertragen Sie dann die Platte aus dem Inkubator zurück in die Haube und geben Sie vorsichtig zwei Milliliter menschliches kortikales Medium für Erwachsene auf die Oberseite des Einsatzes, um das Gewebe vollständig einzutauchen.