Isolierung und Kultivierung von Clostridioides difficile Bakterien aus dem Zebrafischdarm der Larve

Beginnen wir mit einer euthanasierten Zebrafischlarve, deren Darm mit Clostridioides difficile, einem pathogenen anaeroben Bakterium, infiziert ist.

Befestigen Sie den oberen dorsalen Rumpf der Larve und entfernen Sie ihren Kopf, um die inneren Organe freizulegen.

Sichern Sie den mittleren dorsalen Rumpf und isolieren Sie den Darm sanft von der Körperhöhle.

Den isolierten Darm in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit Puffer überführen.

Homogenisieren Sie den Darm mit einem Stößel, um das Gewebe zu stören und die Darmmikroben freizusetzen.

Das Homogenat in ein Röhrchen mit selektiven Aufzuchtmedien überführen, die mit Antibiotika versetzt sind.

Inkubieren Sie das Homogenat in einer anaeroben Kammer.

Anaerobe Bedingungen hemmen das Wachstum aerober Bakterien, während Antibiotika spezifisch auf das Wachstum nativer anaerober Darmmikroben abzielen und es unterdrücken.

Clostridioides difficile ist resistent gegen diese Antibiotika und vermehrt sich unter anaeroben Bedingungen.

Nährstoffe und Wachstumsfaktoren in den Aufzuchtmedien fördern die Zellteilung weiter und ermöglichen das Wachstum lebensfähiger Clostridioides difficile.

Nach dem Einschläfern der infizierten Zebrafischlarven wird eine Nadel in den dorsalen Rüssel der Zebrafischlarven nahe dem Kopf eingeführt, um den Zebrafisch ruhig zu stellen. Entfernen Sie den Kopf hinter den Kiemen mit einer Lanzette.

Führen Sie eine zweite Nadel in die Mitte des dorsalen Rumpfes ein. Führen Sie eine dritte Nadel in den Bauch des Zebrafisches ein und ziehen Sie den Darm aus der Körperhöhle. Verwenden Sie eine Mikroinjektionsnadel, um 10 bis 15 Därme in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen zu übertragen, das 200 Mikroliter steriles 1X PBS enthält.

Homogenisieren Sie den Darm mit einem Stößel, um das Gewebe aufzubrechen und Homogenate vorzubereiten. Stellen Sie sicher, dass der Stößel den Boden des Röhrchens erreicht, um alle Eingeweide vollständig zu zerstören. In die Homogenate wird Clostridioides difficile Aufzuchtmedium gegeben, das D-Cycloserin und Cefoxitin enthält, mit oder ohne Taurocholat, gegeben und in einer anaeroben Kammer inkubiert.