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Mikrobiologie
0 Aufrufe • 2:44 Min. • October 30th, 2025
Nehmen Sie ein SDS-PAGE-Gel, das Proteinbanden aus Membranprotein-Nanolipoprotein-Partikeln enthält. Diese Komplexe tragen das Chlamydien oligomere Membranprotein (MP), ein vielversprechendes Impfstoffantigen gegen Chlamydien-Infektionen .
Verwenden Sie als Kontrolle Proteinbanden aus gereinigtem oligomerem MP.
Montieren Sie das Gel, die Western-Blot-Membran und die Blotting-Komponenten in einem Dry-Blotting-System.
Anlegen eines elektrischen Stroms, um die aufgelösten Proteine auf die Membran zu übertragen.
Entfernen Sie die Membran und inkubieren Sie sie in einem Puffer, der Detergenzien und Primärantikörper enthält.
Die Detergenzien blockieren unspezifische Interaktionsstellen, während die primären Antikörper auf das MP abzielen.
Waschen Sie die Membran, um ungebundene Primärantikörper zu entfernen.
Inkubieren Sie mit Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörpern, die auf die Primärantikörper abzielen.
Waschen Sie die Membran, um überschüssige Sekundärantikörper zu entfernen.
Nehmen Sie Fluoreszenzbilder der Membran auf.
Molekulare Banden, die mit dem oligomeren MP der Kontrolle übereinstimmen, bestätigen die strukturelle Integrität des MP innerhalb der Komplexe und unterstützen sein antigenes Potenzial.
Lösen Sie die Proben mit SDS-PAGE auf und übertragen Sie die Gelstapel mit einem kommerziellen Dry-Blotting-System für die Western-Blot-Analyse. Nehmen Sie die Blots aus dem Stapel und inkubieren Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius in einem Blockierungspuffer, der 0,2 % TWEEN 20 und 0,5 Mikrogramm pro Milliliter MAb40 oder 0,2 Mikrogramm pro Milliliter MAbHIS-Anti-HIS-Tag-Antikörper enthält, der gegen den HIS-Tag aus dem Delta-49ApoA1-Protein gerichtet ist.
Waschen Sie jeden Fleck dreimal fünf Minuten lang pro Wäsche mit PBST. Inkubieren Sie die Blots eine Stunde lang in einem Blockierungspuffer, der einen Sekundärantikörper enthält, der an ein Fluorophor in einer Verdünnung von 1 bis 10.000 konjugiert ist. Wiederholen Sie die Waschungen mit PBST und nehmen Sie das Bild nach dem letzten Waschen mit einem Fluoreszenz-Imager auf.