Isolierung von Endosporen aus einer Umweltprobe durch gezielte Lyse vegetativer Zellen

Nehmen Sie eine Umweltprobe mit vegetativen Zellen und Endosporen eines endosporenbildenden Bakteriums sowie anderer Bakterien.

Endosporen besitzen eine schützende Hülle, die ihnen hilft, unter widrigen Bedingungen zu überleben.

Mit einer Vakuumfiltrationseinheit wird die Probe gefiltert, um die Zellen und Endosporen auf einer Membran einzuschließen.

Legen Sie die Membran in eine Schale und schneiden Sie sie in kleine Stücke.

Die Stücke in ein Rohr überführen, einen Puffer hinzufügen und das Rohr bewegen, um die Zellen und Endosporen freizusetzen.

Inkubieren Sie mit Bewegung bei hoher Temperatur, um die vegetativen Zellstrukturen zu schwächen, ohne die Endosporen zu schädigen.

Die Probe abkühlen, dann Lysozym hinzufügen und mit Rührung inkubieren. Lysozym stört die Zellwand der vegetativen Zellen, wodurch diese platzen.

Fügen Sie Natriumhydroxid und ein Reinigungsmittel hinzu und inkubieren Sie, um die zellulären Makromoleküle und Ablagerungen abzubauen, während die widerstandsfähigen Endosporen erhalten bleiben.

Filtern Sie die Probe, um die Endosporen zu isolieren. Waschen Sie die Endosporen, um überschüssige Reagenzien zu entfernen, und bereiten Sie sie für weitere Analysen vor.

Sobald die Filtrationseinheit und die Vakuumpumpe gemäß dem Textprotokoll vorbereitet sind, verwenden Sie eine mit Ethanol beleuchtete sterilisierte Pinzette, um der Filtrationseinheit eine sterile Nitrocellulosemembran hinzuzufügen. Gib die Hälfte der gerade vorbereiteten Supernatantprobe auf die Membranfiltrationseinheit und benutze die Vakuumpumpe, um die Zellen auf der Membran zu sammeln. Wenn die Flüssigkeit vollständig durch den Filter gelaufen ist, stoppen Sie die Vakuumpumpe.

Verwenden Sie sterilisierte Pinzetten, um die Membran vorsichtig zu entfernen und in eine sterile Petrischale zu geben. Mit einem frischen Stück steriler Membran wiederholen Sie die Filtration mit der restlichen Hälfte der Lösung. Um Endosporen von den vegetativen Zellen in der gerade gesammelten Biomasse zu trennen, tauen Sie die Membran auf, wenn sie eingefroren war, und verwenden Sie mit ethanolbeflammten, sterilisierten Scheren, um sie in kleinere Stücke zu schneiden.

Übertragen Sie die Membranstücke in ein steriles Zwei-Milliliter-Rohr und fügen Sie 900 Mikroliter 1X TE-Puffer hinzu. Gründlich durch Vortex mischen, um die Biomasse aus der Membran freizusetzen. Inkubieren Sie das Rohr bei 65 Grad Celsius und 80 U/min für 10 Minuten.

Dann entferne ich das Rohr aus dem Inkubator und lasse es 15 Minuten abkühlen. Fügen Sie 100 Mikroliter frisch vorbereitetes Lysozym zu einer Endkonzentration von zwei Milligramm pro Milliliter hinzu und inkubieren Sie die Probe bei 37 Grad Celsius und 80 U/min für 60 Minuten, um die vegetativen Zellen zu lysieren. Nach Abschluss der Lyse werden 250 Mikroliter 3 normales Natriumhydroxid und 250 Mikroliter 6% SDS-Lösung zur Probe gegeben. Inkubieren Sie bei Raumtemperatur und 80 U/min für 60 Minuten.

Als Nächstes bereiten Sie eine sterile Filtrationseinheit vor, die durch Autoklavierung Membranen mit 25 Millimeter Durchmesser hält. Nachdem die Filtrationseinheit abgekühlt ist, wird eine Nitrocellulose-Membran mit einem Durchmesser von 25 Millimetern (0,2 Mikrometer) darauf gelegt.

Man fügt die Probe auf die Membran an und verwendet die Vakuumpumpe, um die Flüssigkeit zu filtern, wodurch die Endosporen auf der Membran aufgenommen werden, während das vegetative Zellmaterial hindurchfließt.