JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Mikrobiologie
0 Aufrufe • 3:21 Min. • February 26th, 2026
Beginnen Sie mit einer Petrischale, die eine Kokultur aus Bdellovibrio bacteriovorus, einem räuberischen Bakterium, und E. coli, seiner Beute, unter einem Agarose-Pad enthält.
Das Agarose-Pad hält E. coli bewegungsunfähig, während B. bacteriovorus beweglich bleibt und aktiv in Beutezellen eindringt.
Der Räuber zeigt einen roten zytoplasmatischen Marker und einen grünen fluoreszierenden Tag, der zur Visualisierung mit einer DNA-Polymerase-Untereinheit verschmolzen ist.
Sichern Sie die Schale in einem Halter und tragen Sie Immersionsöl auf den Boden der Schüssel und das Mikroskopobjektiv für optimale Auflösung auf.
Installieren Sie den Halter am Mikroskop und konfigurieren Sie ihn für die Zweikanal-Fluoreszenzdetektion.
Verwenden Sie Hellfeldoptik, um die Brennweite zu lokalisieren, und wählen Sie mehrere nicht überlappende Bildfelder aus.
Stellen Sie Zeitrafferparameter ein, um sowohl Hellfeld- als auch Fluoreszenzbilder sequentiell in definierten Abständen aufzunehmen.
Diese Methode ermöglicht die Beobachtung der Prädation, beginnend mit der Beuteanhaftung und Invasion, gefolgt von der Umwandlung von Beute-Zellen, filamentartigem Wachstum, Septation, Nachkommenbildung bis hin zur Beute-Zelllyse.
Für die Zeitraffer-Fluoreszenzmikroskopie der Kokultur wird die Schale in einen Petrischalenhalter gelegt, sodass die Schale sich im Verlauf des Experiments nicht bewegt, und einen Tropfen Tauchöl auf das umgedrehte Mikroskopobjektiv sowie einen Tropfen auf den Boden der Schale gegeben. Montage des Halters auf der Mikroskopbühne innerhalb der umgekehrten Mikroskopkammer und in der Mikroskopsoftware stellen Sie die Vergrößerung auf 100-fach und die polychrome Linse auf GFP und mCherry ein. Mit einem Okular in Brightfield lokalisieren Sie die Brennebene und öffnen Sie den Punktlistenmanager.
Bewegen Sie die Bühne und verwenden Sie die Schaltfläche "Punkte markieren ", um die Koordinaten von mindestens 10 interessanten Positionen zu speichern. Wechsel das Kameraventil vom Okular auf den Monitor. Stellen Sie die Brennebene ein und klicken Sie im Punktlistenmanager auf die Schaltfläche "Punkt ersetzen ", um jeden Punkt zu kalibrieren.
Öffnen Sie den Experimentdesigner und entmarkieren Sie die Krankheitsstapelbox. Wählen Sie die passenden Leuchtstoffkanäle und die optimalen Beleuchtungseinstellungen aus und legen Sie die Intervalle zwischen Bildaufnahme und Gesamtzeit des Experiments fest. Aktivieren Sie die Fokuspflege für die gewählten Positionen und wählen Sie den Datenordner aus, in dem die Bilddateien automatisch gespeichert werden sollen.
Überprüfen Sie alle Einstellungen in der Mikroskop-Softwaresteuerung erneut und starten Sie das Zeitrafferexperiment. Nach der ersten Stunde des Experiments überprüfen Sie, ob alle Bühnenpositionen noch scharf sind. Nach Abschluss des Zeitraffer-Experiments entferne die Petrischale und entsorge die 35-Millimeter-Schale mit einem Agarose-Pad gemäß den entsprechenden Biosicherheitsprotokollen.