Entstehung von Spheroplasten aus gramnegativen Bakterien

Nehmen Sie ein Medien, das ein Antibiotikum zur Zellteilung blockiert.

Inokulieren Sie es mit stabförmigen, gramnegativen Bakterien.

Inkubieren Sie mit Zittern.

In Gegenwart des Antibiotikums wachsen die Bakterien weiter, ohne sich zu teilen, und bilden lange Filamente.

Sammeln Sie die Kultur und zentrifugieren Sie sie bei niedriger Temperatur. Entsorge das Überdachte und wasche die Filamente mit einer Saccharoselösung, um Lyse zu verhindern.

Verwerfen Sie die Saccharoselösung.

Füge einen Puffer hinzu, gefolgt von Enzymen und EDTA. EDTA schwächt die äußere Membran, sodass Lysozym in die Peptidoglykan-Schicht eindringen und sie abbauen kann.

Dies entfernt die Zellwand, sodass die bakterielle Zelle schrumpfen kann. DNase I bricht die freigesetzte chromosomale DNA aus den Zellen ab und verhindert das Klumpen von Zellen.

Fügen Sie eine hypotonische Lösung mit sanftem Wirbel hinzu, sodass die Zelle Wasser aufnehmen kann.

Die flexiblen Membranen ermöglichen es der Zelle, eine kugelförmige Form anzunehmen, die als Spheroplast bezeichnet wird.

Übertragen Sie einen Aliquot mit den Spheroplasten in zwei Röhren mit einer gekühlten isotonen Lösung, um die Spheroplasten zu stabilisieren.

Um gramnegative E.coli-Spheroplasten herzustellen, verdünnen Sie die Übernachtkultur mit einem Verhältnis von 1 bis 100 in 25 Millilitern TSB in einer 250-Milliliter-Flasche und bringen Sie die Bakterien für weitere 2,5 Stunden zurück in den schüttelnden Inkubator. Wenn die Lösung eine optische Dichte von 0,5 bis 0,8 bei 600 Nanometern erreicht hat, verdünnen Sie die Kultur im Verhältnis eins zu zehn in frischem TSB in einer neuen 250-Milliliter-Flasche für eine zweite 2,5-stündige Inkubation mit einer endgültigen effektiven Konzentration von 60 Mikrogramm pro Milliliter Cephalexin.

Einzellige Filamente von etwa 50 bis 150 Mikrometern Länge herzustellen, wie sie unter einem Lichtmikroskop bei 1000-facher Vergrößerung visualisiert werden. Zentrifugiere die bakterielle Lösung, um die Filamente zu entnehmen, und dekantiere das Supernatant. Waschen Sie die Filamente mit vorsichtiger Zugabe von einem Milliliter 0,8 molaren Saccharose und achten Sie darauf, das Pellet nicht zu stören.

Nach einer Minute entsorgt man den Supernatanten, ohne das Pellet zu stören, und fügt die angegebenen Reagenzien in der jeweiligen Reihenfolge zu den Filamenten hinzu. Nach zehn Minuten bei Zimmertemperatur werden nach und nach ein Milliliter Lösung A über einen Zeitraum von einer Minute hinzugefügt und die Lösung vorsichtig von Hand gewirbelt. Inkubieren Sie die Lösung vier Minuten lang bei Raumtemperatur und teilen Sie die Filamentsuspension dann in zwei gleich große Aliquoten zwischen zwei 15-Milliliter-Kegelröhren mit sieben Millilitern vier Grad Celsius Lösung B. Anschließend werden die Filamente durch Zentrifugation gepelletiert und mit einer serologischen Pipette vorsichtig alle bis auf ein bis zwei Milliliter des Supernatanten entfernt werden, ohne die Pellets zu stören.

Verwenden Sie eine P1000-Mikropipette, um die Pellets vorsichtig wieder aufzuhängen. Überprüfen Sie ein kleines Aliquot der Probe auf Spheroplastbildung mittels Lichtmikroskopie. Der Spheroplast kann dann bis zu einer Woche bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden oder bis sie drei Gefriertauzyklen durchlaufen haben.