Name: RNA-Interferenz in Ticks (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-20T19:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Lernen Sie die RNA-Interferenz in Zecken durch Injektion von doppelsträngiger RNA. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Genfunktionen und biologischen Parametern zur Entwicklung von Kontrollstrategien gegen Zecken.

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Wir danken Mitglieder unseres Labors für fruchtbare Diskussionen und technische Unterstützung. Dieses Video-Präsentation wurde von der Prodekan für Forschung und das Department of Veterinary Pathobiologie, Center for Veterinary Health Sciences, Oklahoma State University unterstützt. Die Forschungen des Ministerio de Ciencia e Innovación, Spanien (Projekt BFU2008-01244/BMC), die CSIC intramural Projekt PA1002451 zu JF finanziert wurde, Stiftungslehrstuhl der Walter R. Sitlington Chair for Food Animal Research zu KMK, CVHS 2009 RAC gewähren, OAE Animal Health Funds und USDA, National Research Initiative Competitive Grant, Nr. 2007-04613.

1. Generierung von dsRNA. <ol><li> Synthesize Oligonukleotidprimer mit T7-Promotor-Sequenzen für in vitro-Transkription und Synthese von dsRNA (z. B. für Dermacentor variabilis subolesin verwenden Oligonukleotidprimer D8AAT75: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGTACTGACTGGGATCCCCTGCACAGT-3 'und D8DVT73: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGTACTCGAGCTTGGTGGAAAGGACG-3'). </li><li> Amplify Zielgens durch RT-PCR mit 10 pmol von jedem Oligonukleotid-Primer und 1-10 ng von Zecken Gesamt-RNA. </li><li> Purify das PCR-Produkt. </li><li> Synthesize dsRNA mit 8 ul des gereinigten PCR-Produkt. </li><li> Quantify dsRNA durch Spektrometrie. </li></ol> 2. Die Injektion von Zecken mit dsRNA. 2.1. Vorbereitung von Zecken zur Injektion. <ol><li> Zuerst waschen Sie die Zecken in eine Reihe von Lösungen durch Schütteln in jeder Lösung in einer 50 ml-Einweg-Zentrifugenröhrchen, Dekantieren der Lösung durch ein feinmaschiges Drahtgitter über den Schlauch oben nach Zecken zu behalten. Die Reihenfolge der Lösungen für das Waschen Zecken ist Leitungswasser, 3% Wasserstoffperoxid, zwei Wäschen destilliertes Wasser, 70% Ethanol und zwei weitere Waschungen mit destilliertem Wasser. </li><li> Blot-dry die Zecken auf Küchenpapier. </li><li> Zählen Sie die Zecken in Gruppen von 20 bis 50, je nach Experiment, legen Sie die Zecken aus jeder Gruppe in einem 1,25 Unzen Plastikbecher mit einem festsitzenden Deckel und Etikett mit den experimentellen Gruppen-Nummer. </li></ol> 2.2. Tick ​​Injektion Team. Die RNAi-Team besteht aus drei Personen: (1) eine Person, die jeder Tick-Positionen auf doppelte Klebeband angebracht, um ein Blatt rot Dentalwachs, (2) eine Person, die die Zecken und (3) einer Person, die die Zecken-Monitore nach injiziert Injektion, atmet CO 2 auf die Zecken, um sie zu aktivieren und zählt die lebende Zecken in die Tassen mit den experimentellen Gruppen-Nummer gekennzeichnet. Alle Teammitglieder müssen Einmalhandschuhe tragen. 2.3. Platzierung von Zecken zur Injektion. <ol><li> Nehmen Sie ein Häkchen mit Dumont feinen Pinzette und legen Sie sie Bauchseite auf Doppel-Klebeband befestigt, um ein 3 "x 6" Blatt rot Dentalwachs. Die Zecken sind eng in Gruppen von 5 ticks positioniert. </li><li> Setzen Sie einen kleinen Streifen Klebeband über die Mundwerkzeuge der alle 5 Ticks, um weitere zurückhalten, aber während verlassen die meisten der Körper so, dass die Injektion Prozess durch die Zecke Injektor (Abbildung 1) beobachtet werden ausgesetzt. </li></ol> 2.4. Die Injektion von Zecken. <ol><li> Die Zecken werden in der rechten unteren Quadranten der ventralen Oberfläche des Exoskelett injiziert werden. </li><li> Erstens stechen ein Loch in das Exoskelett mit einem Monoject Insulinspritze mit einem ½ ", 29-Gauge-Nadel (Abbildung 2a) ausgestattet. </li><li> Inject Zecken sofort mit 0,2-0,5 ul der dsRNA-Lösung (5 x 10 bis 5 Oktober x 10 11 Moleküle pro Mikroliter) mit einem maßgeschneiderten Hamilton-Spritze mit einer 1 Zoll, 33-Gauge-Nadel mit einer 45 ° abgeschrägt Punkt (Abb. 2b) . Die Nadel sollte gut in der Zecke Hohlraum platziert werden, um die Platzierung und die Beibehaltung der dsRNA zu gewährleisten. Einige Flüssigkeit wird wahrscheinlich von der Injektionsstelle (Abbildung 2c) zu entkommen. Es sollte darauf geachtet werden, dass über injizieren die Zecken, die den Verlust der Hämolymphe verursachen würde und konnte den Tod der Zecke verursacht werden. </li><li> Reinigen Sie die Hamilton-Spritze nach Abschluss der Injektionen in jeder experimentellen Gruppe. vor der Verwendung für einen anderen experimentellen Gruppe. Füllen Sie die Spritze zunächst aus einem Becherglas mit 3% Wasserstoffperoxid und dann vertreiben in einen Abfallbehälter, und wiederholen Sie 15-mal. Füllen Sie die Spritze aus einem Becherglas mit sterilem Wasser und dann vertreiben in einen Abfallbehälter, und wiederholen Sie 15-mal. Achten Sie darauf, den Kolben der Spritze Hamilton beugen, denn wenn gebogen, der Kolben wird nicht reibungslos bewegen und reagieren auf die sanfte Berührung für die Injektion von Zecken erforderlich. </li></ol> 2.5. Die Behandlung von Zecken nach der Injektion. <ol><li> Nehmen Sie den injizierten Tick sofort aus dem Doppel-Klebeband mit der feinen Pinzette und legen Sie sie in einem Kunststoff-Verwertung-Container (ca. 6 "x 6" und beringt mit Klebeband zu entkommen der Zecken zu verhindern). Die Zecken werden kurz nach der Injektion nicht aktiv, sollte aber bald beginnen, um die Schale zu kriechen. </li><li> Atem CO 2 auf die Zecken sofort nach dem Einlegen in das Recovery-Container zu helfen, aktivieren Sie die Zecken. Sobald die Zecken krabbeln und aktiv sind, wird die Injektion Wunde schnell heilen, und sie werden wahrscheinlich überleben. </li><li> Zählen Sie die Zecken nach der Zahl in jeder experimentellen Gruppe und legen Sie sie in ein markiertes Plastikbecher mit einem festsitzenden Deckel. Ersatz Zecken sollten injiziert, um jedem, dass jeder vor der Injektion der nächsten experimentellen Gruppe starb ersetzen. </li></ol> 2.6. Tick ​​halten. <ol><li> Legen Sie die Zecken in eine feuchte Kammer (12-Stunden Licht: 12 Stunden Dunkelheit Photoperiode bei 22-25 ° C und 95% relative heuchte) und halten Sie für 1 Tag. </li><li> Legen Zecken in tick-Fütterung Zellen, eine pro Versuchsgruppe, um ein Schaf geklebt und es ihnen ermöglichen, mit einer gleichen Anzahl von injizierten männlichen oder weiblichen Zecken (je nachdem, Sex war nicht gespritzt) zu ernähren. Weibliche Zecken, die Sättigung füttern, haben diejenigen, die von den Schafen nach 10 Tagen der Fütterung oder wenn die Kontroll-Weibchen entfernt werden aus dem Host werden gesammelt und gewogen gesunken. </li><li> Legen Sie die Zecken in Kartons, und halten Sie in der feuchten Kammer bis zum Abschluss der Eiablage. Bewerten Eiablage durch die Gewichtung der Eimasse von allen Zecken in der Gruppe hergestellt. </li></ol> 2.7. Die Analyse der tick-Phänotyp nach RNAi. <ol><li> Bewerten Tick Phänotyp nach der Fütterung durch die Bestimmung der Anzahl der Ticks, überlebte Tick Gewicht, Eiablage und die Fertilität der Eier. Jedoch können auch andere Analysen durchgeführt je nach Zielgen und Ziele der Studie. </li></ol> 3. Analyse zur Gen-Stummschaltung durch RT-PCR bestätigen. <ol><li> Dissect Speicheldrüsen und Mut einzelner Zecken von Kontroll-injiziert und dsRNA-injizierten Gruppen nach der Fütterung. </li><li> Auszug Gesamt-RNA aus einzelnen Gewebeproben. </li><li> Analysieren Zielgen Transkripte in einzelnen Geweben durch real-time RT-PCR und normalisieren RNA-Spiegel gegen Zecken 16S rRNA mit der genNorm Methode (ddCT Methode, wie von Bio-Rad iQ5 Standard Edition, Version 2.0 implementiert). </li><li> Run Dissoziationskurven am Ende der Reaktion, um sicherzustellen, dass nur ein Amplikon gebildet wird und dass die Amplifikate denaturiert konsequent in der gleichen Temperaturbereich für jede Probe. </li><li> Vergleichen mRNA-Spiegel (normalisiert Ct-Werte) zwischen Kontroll-injiziert und dsRNA-Injektion Zecken mit dem Student `s t-Test (P = 0,05). </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse: Das Protokoll beschriebenen in unserem Labor wurde für RNAi verwendet in vielen verschiedenen Schildzecken Zeckenarten (Tabelle 1). Die Höhe der dsRNA in die Zecken injiziert variiert mit der Größe der Zecke, größere Zeckenart kann ein größeres Volumen unterzubringen. Negative Kontrolle Zecken sollten mit einem unabhängigen, dsRNA injiziert werden. Mehrere dsRNAs wie subolesin 14-19,22-25,27-32,34 und beta-Aktin 20,21 könnte als positive Kontrollen verwendet werden. Beachten Sie, dass es wichtig ist, die Spritze zwischen den Behandlungen zu mischen dsRNA Lösungen zu vermeiden waschen. Wenn das Protokoll korrekt erfolgt ist, sollte weniger als 5% Mortalität von der Injektion nach 24 Stunden erreicht werden. Eine typische Phänotyp nach Gen Knockdown in Zecken ist in Abbildung 3 mit einem Panel von Zecken mit Pools von dsRNA in Ordnung injiziert, um Bildschirm für Zecken schützende Antigene gezeigt. <table border="1"><tbody><tr><td> Zeckenarten </td><td> dsRNA injiziert </td><td> Referenzen </td></tr><tr><td> Ixodes scapularis </td><td> cDNA-Bibliothek, subolesin, Aktin, Nukleotidase, NF-kB, Akirin </td><td> 21, 22, 29, 30 </td></tr><tr><td> Dermacentor variabilis </td><td> subolesin, GST, Ubiquitin, vATPase, Selenoproteinen M und W2a, hämatopoetischen Stammzellen / Vorläuferzellen Protein-like, Aktin Proteasome 26S-Untereinheit, ferritin1, varisin, Akirin </td><td> 15, 19, 22, 24, 26, 30-32 </td></tr><tr><td> Dermacentor marginatus </td><td> subolesin </td><td> 22 </td></tr><tr><td> Amblyomma americanum </td><td> cDNA-Bibliothek, subolesin, Akirin </td><td> 17, 22, 30 </td></tr><tr><td> Amblyomma hebraeum </td><td> subolesin, voraxin </td><td> 28 </td></tr><tr><td> Rhipicephalus sanguineus </td><td> Rs86, subolesin </td><td> 22, 23 </td></tr><tr><td> Rhipicephalus microplus </td><td> GST, Ubiquitin, Selenoprotein, Bm86, Bm91, subolesin, GI, GIII, EF1A, flagelliform Seidenprotein, von-Willebrand- Faktor </td><td> 16, 18, 25, 27 </td></tr><tr><td> Rhipicephalus annulatus </td><td> Ubiquitin, subolesin, EF1A, GIII </td><td> 16 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Tick Arten, in denen die RNAi-Protokoll verwendet wurde. <img src="/files/ftp_upload/2474/2474fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Platzierung von Zecken, Bauchseite nach oben, auf Doppel-Klebeband verklebt auf ein Blatt rot Dentalwachs. Die Zecken sind in Gruppen von 5 gelegt, nach denen ein kleiner Streifen Klebeband über die Mundwerkzeuge platziert wird, um weiteren Sicherung der Zecken und gleichzeitig den Injektor, um den Körper der Zecke während der Injektion zu beobachten. <img src="/files/ftp_upload/2474/2474fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Das Injektionsverfahren umfasst (a) Durchstechen der unteren rechten Quadranten der Zecke Exoskelett mit einer Insulin-syringe mit einer 29 Gauge Nadel ausgestattet um eine Injektionsstelle erstellen, (b) die sofortige Injektion von dsRNA an dieser Stelle mit einer Hamilton-Spritze mit einer 33-Gauge-Kanüle, die (c) am wahrscheinlichsten in eine Leckage von Zecken Hämolymphe / Ergebnis Flüssigkeiten. <img src="/files/ftp_upload/2474/2474fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Ein Gremium von Zecken sechs Gruppen, in denen RNAi auf dem Bildschirm für Zecken schützende Antigene in Amblyomma americanum verwendet wurde. Die phänotypische Veränderungen in Zecken zu sehen, wenn sie mit der positiven subolesin RNAi-Steuerung und die negativen unabhängig dsRNA Kontrolle verglichen werden. In diesem Experiment die Wirkung von RNAi auf Pump Sterblichkeit, Gewichte und Eiablage der einzelnen Gruppen war statistisch analysiert.

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<li>Kocan, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transovarial+silencing+of+the+subolesin+gene+in+three-host+ixodid+tick+species+after+injection+of+replete+females+with+subolesin+dsRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol.+Res%22%5BJournal%5D)">Transovarial silencing of the subolesin gene in three-host ixodid tick species after injection of replete females with subolesin dsRNA.</a> Parasitol. Res. 100, 1411-1415 (2007).</li>
<li>de la Fuente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+tick-pathogen+interface+for+novel+control+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Targeting the tick-pathogen interface for novel control strategies.</a> Front. Biosci. 13, 6947-6956 (2008).</li>
<li>Kurscheid, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+a+tick+RNAi+pathway+by+comparative+genomics+and+reverse+genetics+screen+of+targets+with+known+loss-of-function+phenotypes+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Evidence of a tick RNAi pathway by comparative genomics and reverse genetics screen of targets with known loss-of-function phenotypes in Drosophila.</a> BMC Mol. Biol. 10, 26-26 (2009).</li>
</ol>

Obwohl auch andere Methoden zur RNAi haben in Zecken 14, 33 beschrieben wurde, beschrieb die Injektion von dsRNA ist dabei die am häufigsten in beiden ungefüttert (Tabelle 1) und gefüttert Zecken 16,25,34 verwendet. RNAi hat sich gezeigt, dass ein wertvolles Werkzeug für die Untersuchung von Zecken Genfunktion, die Charakterisierung der tick-Erreger-Schnittstelle und das Screening und Charakterisierung von Zecken schützende Antigene 14,35 sein. Insbesondere hat RNAi wird das wertvollste Werkzeug für funktionelle Analysen in Zecken 35. Methodisch wird RNAi wahrscheinlich in effizientere Methoden, die Gen-Knockdown in einer großen Anzahl von Personen können damit zu entwickeln. Der Mechanismus der dsRNA-induzierte RNAi in Zecken sollten verfeinert werden, um zu einem besseren Verständnis und der Nutzung dieser genetischen Ansatz in dieser Art 35,36 beizutragen. Das Ausmaß der Off-Target-Effekte von RNAi in Zecken ist auch eine wichtige Frage, die umfassend angegangen werden 14,27 Bedürfnisse. Schließlich wird RNAi höchstwahrscheinlich bieten umfassende Beiträge zur Erforschung von Zecken Genregulation und Systembiologie und der tick-Erreger-Schnittstelle und kann einen Einfluss auf die Entwicklung von Impfstoffen zu Zeckenbefall und die Übertragung von Zecken übertragene Erreger zu kontrollieren.

<table><tbody><tr><td>Zugang zu RT-PCR-System</td><td>Promega</td><td>A1250</td><td></td></tr><tr><td>Purelink PCR-Reinigungs-Kit</td><td>Invitrogen</td><td>K3100-02</td><td></td></tr><tr><td>Megascript RNAi-Kit</td><td>Ambion</td><td>AM1626M</td><td></td></tr><tr><td>Rotes Zahnwachs</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72674</td><td></td></tr><tr><td>Kunststoffbecher, 1,25 oz, mit Deckeln</td><td>Solo Cup Company, Urbana Ill.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Feine Pinzette</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>Verschiedene</td><td></td></tr><tr><td>Insulin-Spritze</td><td>Monoject</td><td></td><td>Mit einer &amp;#189;&quot;, 29-Gauge-Nadel ausgestattet</td></tr><tr><td>Hamilton-Spritze</td><td>Hamilton</td><td>701SN,33/.375&amp;#8221;/45DGR</td><td>Spezialanfertigung</td></tr><tr><td>TriReagent</td><td>Sigma</td><td>93289</td><td></td></tr><tr><td>iScript One-Step RT-PCR Kit mit SYBR Green</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8892</td><td></td></tr><tr><td>Echtzeit-PCR-Detektionssystem</td><td>Bio-Rad</td><td>Mehrere</td><td>Siehe &lt;a href=&quot;http://www.bio-rad.com/">http://www.bio-rad.com/&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

rna-interferenz in ticks

RNA Interference in Ticks

Zecken sind obligat hematophagous Ektoparasiten von Wild-und Haustieren und Menschen, und gelten als weltweit an zweiter Stelle, um Stechmücken als Überträger von Krankheiten des Menschen 1 und der wichtigsten Vektoren bei Rindern Industrie weltweit 2 sein. Zecken sind in der Unterklasse Acari, um Parasitiformes, Unterordnung Ixodida klassifiziert und werden weltweit vertrieben von der Arktis bis tropischen Regionen 3. Trotz der Bemühungen um Zeckenbefall kontrollieren, bleiben diese Ektoparasiten ein ernstes Problem für Mensch und Tier 4,5. RNA-Interferenz (RNAi) 6 ist eine Nukleinsäure-basierte reverse genetische Ansatz, dass eine Störung der Genexpression beinhaltet, um Genfunktionen oder ihrer Wirkung auf einen Stoffwechselweg zu bestimmen. Small interfering RNAs (siRNAs) sind die Effektormoleküle der RNAi-Weg, die durch doppelsträngige RNA (dsRNA) und führt zu einer potenten sequenzspezifischen Abbau von cytoplasmatischen mRNAs, die die gleiche Sequenz wie die dsRNA auslösen 7-9 ist eingeleitet. Post-transkriptionelle Gen-Silencing-Mechanismen durch dsRNA initiiert haben in allen Eukaryoten entdeckt bisher untersuchten und RNAi wurde rasch in einer Vielzahl von Organismen als Werkzeug für die funktionale Genomik Studien und andere Anwendungen 10 entwickelt. RNAi hat sich die am weitesten verbreitete Gen-Silencing-Technik in Zecken und anderen Organismen, in denen alternative Ansätze zur genetischen Manipulation sind nicht verfügbar oder unzuverlässig sind 5,11. Die genetische Charakterisierung von Zecken hat bis in die jüngste Anwendung der RNAi 12,13 begrenzt. In der kurzen Zeit, RNAi wurde zur Verfügung, hat es sich als ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung der Zecke Genfunktion, die Charakterisierung der tick-Erreger-Schnittstelle und das Screening und Charakterisierung von Zecken schützende Antigene 14 sein. Hierin wird ein Verfahren für RNAi durch Injektion von dsRNA in ungefüttert Zecken beschrieben. Es ist wahrscheinlich, dass das Wissen aus diesem experimentellen Ansatz gewonnen wird deutlich dazu beitragen, das Verständnis von grundlegenden biologischen Systemen und die Entwicklung von Impfstoffen zu Zeckenbefall kontrollieren und zu verhindern Übertragung von Zecken übertragene Krankheitserreger 15-19.

Ein Verfahren zur RNA-Interferenz (RNAi) durch Injektion von dsRNA in ungefüttert Zecken beschrieben. RNAi ist die am weitesten verbreitete Gen-Silencing-Technik in Zecken, wo die Verwendung von anderen Methoden der genetischen Manipulation eingeschränkt wurde.

RNA-Interferenz in Ticks

Zecken sind obligate hämatophage Ektoparasiten von Wild- und Haustieren sowie Menschen und gelten nach Stechmücken als weltweit zweitwichtigste Vektoren ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Technik der RNA-Interferenz bei Zecken mittels Injektion zu demonstrieren. Dies wird erreicht, indem zunächst doppelsträngige RNA des oder der Gene von Interesse synthetisiert wird. Die RNA wird anschließend in Zecken injiziert, die danach 24 Stunden lang in einer Feuchtigkeitskammer aufbewahrt werden.Nach dieser Ruhephase werden die Zecken letztendlich an einem Tier wie beispielsweise einem Schaf füttern gelassen. Fütterungsparameter wie Gewicht, Häutung und Eiablage sowie die Expression des gezielten Gens oder der Gene von Interesse mittels Echtzeit-R-T-P-C-R werden bestimmt. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die den Effekt der Stilllegung gezielter Gene auf die Zeckenbiologie durch die Auswertung zeckenbiologischer Parameter und der Genexpression mittels Echtzeit-R-T-P-C-R belegen.Unsere Gruppe arbeitet mit Zecken, um molekulare Vorgänge an der Grenzfläche zwischen Zecke und Erreger zu charakterisieren, und nutzt diese grundlegenden Erkenntnisse, um Methoden zur Bekämpfung von Zeckenbefall sowie zur Übertragung von Krankheitserregern auf Menschen und Tiere zu entwickeln. Die RNA-Interferenz hat sich in dieser Forschung als unverzichtbares Werkzeug etabliert, da sie die einzige verfügbare Methode zur genetischen Manipulation von Zecken darstellt. Die Funktion vieler Zeckengene ist unbekannt.Die RNA-Interferenz ermöglicht es uns, die Rolle von Zeckengenen und der Genexpression in vielen Aspekten der Zeckenbiologie zu definieren, einschließlich Paarung, Fortpflanzung, Fütterung, Verdauung, Funktion der Speicheldrüsen und der Vektorfähigkeit der Zecke für die Übertragung von Krankheitserregern. Das Verfahren wird vom RNA-Interferenz-Team für Zecken aus unserem Labor demonstriert: Dr. Ed Lewin, der Doktorand Busby und ich selbst. Um doppelsträngige RNA herzustellen, synthetisieren Sie zunächst Oligonukleotidprimer, die T7-Promotorsequenzen für die In-vitro-Transkription von RNA enthalten.Beispielsweise derma center vari lesin. Verwenden Sie die Oligonukleotidprimer D eight A a T 75 und D eight DVT 73, die hier dargestellt sind. Amplifizieren Sie das Zielgen mittels R-T-P-C-R unter Verwendung von 10 Pikomol jedes Oligonukleotidprimers und ein bis 10 Nanogramm gesamter Zecken-RNA.Als Nächstes reinigen Sie das PCR-Produkt. Verwenden Sie anschließend acht Mikroliter oder etwa 100 Nanogramm, um doppelsträngige RNA herzustellen. Um die Zecken für die Injektion vorzubereiten, waschen Sie die Zecken zunächst in der folgenden Abfolge von Lösungen: Leitungswasser, 3 % Wasserstoffperoxid, zweimal destilliertes Wasser, 70 % Ethanol und zwei abschließende Spülungen mit destilliertem Wasser.Führen Sie jede Waschung in einem 50-Milliliter-Wegwerfzentrifugenröhrchen durch Schütteln durch. Danach gießen Sie die Lösung durch ein feines Maschendrahtsieb ab. Trocknen Sie die Zecken auf Papierhandtüchern ab und portionieren Sie sie je nach Experiment in Gruppen von 20 bis 50. Stellen Sie jede Gruppe in einen 1,25-Unzen-Kunststoffbecher mit dicht schließendem Deckel und beschriften Sie jeden Becher mit der entsprechenden Versuchsgruppe. Danach bilden Sie ein RNAi-Team aus drei Personen, das den Injektionsvorgang durchführen wird. Die erste Person positioniert jeden Zecken auf doppelseitigem Klebeband, das auf einem drei mal sechs Zoll großen Stück rotem Zahnwachs befestigt ist.Die zweite Person injiziert die Zecken, und die dritte beobachtet die Zecken nach der Injektion, bläst Kohlendioxid auf die Zecken, um sie zu aktivieren, und zählt die lebenden Zecken, um sie anschließend in Becher zu überführen, die mit der Nummer der Versuchsgruppe beschriftet sind. Alle Teammitglieder müssen Einweghandschuhe tragen. Um den Injektionsprozess bei den Zecken zu beginnen, fangen Sie eine Zecke mit feinen Dumont-Forceps ein und legen Sie sie dorsal nach unten auf doppelseitiges Klebeband, das auf einer roten Wachsplatte befestigt ist. Positionieren Sie die Zecken in Gruppen zu je fünf. Legen Sie einen kleinen Streifen Abdeckband über die Mundwerkzeuge aller fünf Zecken.Um sie weiter einzuschränken, lassen Sie den größten Teil des Körpers frei, damit der Zeckeninjektor den Injektionsvorgang beobachten kann. Stechen Sie zur Injektion der Zecke mit einer Mono-Eject-Insulinspritze, die mit einer 29-Gauge-Halbzoll-Nadel ausgestattet ist, ein Loch in das untere rechte Quadrant der ventralen Oberfläche des Exoskeletts. Injizieren Sie anschließend unmittelbar 0,2 bis 0,5 Mikroliter einer doppelsträngigen RNA-Lösung mit einer speziell angefertigten Hamilton-Spritze und einer 33-Gauge-ein-Zoll-Nadel mit 45-Grad-Abgeschrägung; führen Sie die Nadel tief in den Zeckenkörper ein, um eine sichere Platzierung und Retention der doppelsträngigen RNA zu gewährleisten.Auch wenn nach der Injektion Flüssigkeit austritt, gewährleistet eine tiefe Nadelplatzierung, dass eine ausreichende Menge doppelsträngiger RNA in die Zeckenkörperhöhle injiziert wird, um eine Genstilllegung zu bewirken; es ist darauf zu achten, keine Überinjektion durchzuführen. Das Injizieren der Zecken führt zum Verlust von Hämolymphe und zum Absterben der Zecke. Unmittelbar nach der Injektion sind die Zecken mit feiner Pinzette vom doppelseitigen Klebeband abzuheben und in einen Kunststoff-Regenerationsbehälter zu überführen.Die Zecken verbleiben nach der Injektion kurzzeitig inaktiv, sollten aber bald darauf beginnen, sich in der Schale zu bewegen. Aktivieren Sie die Zecken, indem Sie Kohlendioxid auf sie ausatmen. Sobald die Zecken kriechen und aktiv sind, heilt die Injektionswunde rasch, und sie werden höchstwahrscheinlich überleben.Zählen Sie die Zecken in jeder Versuchsgruppe und geben Sie jede Gruppe in einen beschrifteten Plastikbecher mit fest sitzendem Deckel. Ersetzen Sie alle Zecken, die in der aktuellen Gruppe sterben, bevor Sie die nächste Versuchsgruppe injizieren. Reinigen Sie die Hamilton-Spritze vor der Injektion der nächsten Versuchsgruppe, indem Sie sie mit frischem 3 %igem Wasserstoffperoxid füllen und anschließend entleeren.15-mal, gefolgt von 15 Spülgängen mit steriler Wasser. Achten Sie darauf, den Kolben der Hamilton-Spritze nicht zu verbiegen, da er sonst nicht mehr gleichmäßig gleitet und nicht auf die sanfte Berührung reagiert, die für die Zeckeninjektion erforderlich ist. Nach der Injektion bringen Sie die Zecken in eine Kammer mit einem Behälter, der mit Wasser und Kaliumsulfat gefüllt ist, um eine hohe Luftfeuchtigkeit aufrechtzuerhalten, und lassen Sie sie dort einen Tag lang. Bringen Sie anschließend einzelne Zecken in Zeckenfütterungszellen ein, die an ein Schaf geklebt sind, und lassen Sie sie mit einer gleichen Anzahl nicht injizierter männlicher oder weiblicher Zecken füttern, je nachdem, welches Geschlecht nicht injiziert wurde. Sammeln Sie die weiblichen Zecken nach Abschluss der Fütterung von der Fütterungszelle ab, nach etwa 10 Tagen oder sobald die Kontrollweibchen abgefallen sind, und inkubieren Sie jede Gruppe von Zecken in einer Feuchtekammer, bis die Eiablage abgeschlossen ist. Bewerten Sie die Eiablage je Gruppe, indem Sie die Eimasse wiegen, die von allen Zecken einer Gruppe produziert wurde, um das Zecken-Phänotyp nach der Fütterung zu bewerten.Bestimmen Sie die Anzahl der überlebenden Zecken und berechnen Sie das Zeckengewicht sowie die Eiablage und die Fruchtbarkeit der Eier. Abhängig vom Zielgen und den Studienzielen können weitere Analysen durchgeführt werden, um die Genstilllegung mittels R-T-P-C-R zu bestätigen. Nach der Fütterung dissezieren Sie die Speicheldrüsen und Därme einzelner Zecken aus den Gruppen mit Kontrollinjektion und mit doppelsträngiger RNA-Injektion und extrahieren anschließend die Gesamt-RNA aus den einzelnen Gewebeproben. Analysieren Sie die Transkripte des Zielgens in einzelnen Geweben mittels Echtzeit-RTPCR und normalisieren Sie die RNA-Spiegel gegenüber der 16S-ribosomalen RNA der Zecke. Führen Sie mithilfe der Gen-Norm-Methode am Ende der Reaktion Schmelzkurvenanalysen durch, um sicherzustellen, dass jeweils nur ein Amplikon gebildet wird und dass die Amplikone in jedem Probe in dem gleichen Temperaturbereich konsistent denaturieren. Vergleichen Sie die normalisierten CT-Werte für die mRNA-Spiegel zwischen kontrollinjizierten und mit doppelsträngiger RNA injizierten Zecken unter Verwendung des Student’schen t-Tests.Das hier beschriebene Protokoll wurde in unserem Labor für die RNAi-Technik bei vielen verschiedenen exotischen Zeckenarten verwendet. Die Menge an doppelsträngiger RNA, die in die Zecken injiziert wird, variiert je nach der Größe der Zecke. Größere Zeckenarten können ein größeres Volumen aufnehmen.Die Referenzen finden sich im begleitenden schriftlichen Teil des Protokolls. Wenn das Protokoll korrekt durchgeführt wird, sollte die Mortalität nach der Injektionsprozedur nach 24 Stunden weniger als 5 % betragen. Ein typisches Phänotyp nach der Genstilllegung bei Zecken ist hier dargestellt, wobei eine Gruppe von Zecken mit Pools aus doppelsträngiger RNA injiziert wurde, die zur Identifizierung zeckenprotektiver Antigene verwendet wurden.Bei Zecken, die mittels Lichtmikroskopie untersucht werden, können zelluläre Degenerationen in den Zeckengeweben beobachtet werden. Phänotypische Veränderungen können zudem mit einem Funktionsverlust einhergehen. Beispielsweise führt die RNAi von SUBIN zu sterilen Männchen, die nicht erfolgreich mit Weibchen paaren können, nach RNA-Interferenz und Zecken.Andere Methoden können verwendet werden, um die Auswirkungen der Genstilllegung auf die Gen- und Proteinausprägung sowie auf die Zeckenbiologie zu untersuchen, einschließlich Echtzeit-R-T-P-C-R, Licht-, Elektronen- oder konfokaler Mikroskopie. Genomik oder Proteomik. Die RNA-Interferenz kann auch in Zeckenzellkulturen durchgeführt werden und bietet eine in-vitro-Methode zur Untersuchung von Interaktionen zwischen Zeckenzellen und Pathogenen.

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Lyme-Borreliose Studien erfordern oft Generation von Zecken mit dem Erreger Borrelia burgdorferi, ein Prozess, der dauert in der Regel mehrere Wochen infiziert. Hier zeigen wir eine Mikroinjektion-basierte Zecken Infektion Verfahren, das innerhalb weniger Stunden erreicht werden kann. Wir zeigen auch einer Immunfluoreszenz-Methode zur in situ-Lokalisation von B. burgdorferi in Zecken.

Methoden zur raschen Transfer und die Lokalisierung von Lyme-Borreliose Erreger innerhalb der Tick Gut

Lyme-Borreliose ist die am häufigsten berichteten Vektor-übertragene Krankheit in Nordamerika. Der Erreger ist Borrelia burgdorferi Spirochäten Bakterium übermittelt durch Schildzecken. Übertragung und Erfassung von Infektionen in Tiermodellen durch die Verwendung von Zecken Fütterung, die wir hier beschreiben optimiert.

Fütterung von Zecken auf Tiere, die zur Übertragung und Xenodiagnosis in Lyme Disease Research

Die Produktion von gesunden Labor aufgezogen Zecken ist wichtig, um Studien über tick Biologie und tick-Pathogen-Interaktionen. Hier zeigen wir ein einfaches Protokoll für unreife Zecken Fütterung, die kostengünstiger und weniger belastend für Mäuse ist.

Aufzucht<em&gt; Ixodes scapularis,</em&gt; Die schwarzbeinigen Tick: Fütterung unreife Stadien auf Mäusen

Nested PCR ist eine sensible, spezifische und einfache Technik, die Zecke kann, die DNA extrahiert angewendet werden, um Borrelia Burgdorferi, dem Erreger der Lyme-Borreliose untersuchen. Das erste PCR-Experiment verwendet gen-spezifische Primer, um lange Amplifikate zu generieren, die dann Vorlagen für eine nachfolgende Reaktion unter Verwendung der internen Zündkapseln werden.

Das Lyme Krankheit Spirochete, Borrelia Burgdorferiin Zecken mit verschachtelten PCR zu erkennen

Hier präsentieren wir ein Next Generation Sequencing-Protokoll für die 16 s rRNA-Sequenzierung die Identifizierung und Charakterisierung mikrobieller Gemeinschaften in Vektoren ermöglicht. Bei dieser Methode wird die DNA-Extraktion, Amplifikation und Barcoding der Proben durch PCR, Sequenzierung auf eine-Durchflusszelle und Bioinformatik Sequenzdaten phylogenetische Informationen übereinstimmen.

Tick Microbiome Charakterisierung von Next-Generation-16 s rRNA Amplikons Sequenzierung

In dieser Studie wurde ein Fütterungssystem für Nymphal- und Larvenstadien von harter Zecke mit einer Kapsel entwickelt, die an laboratorischen Mäusen befestigt ist. Die Fütterungskapsel besteht aus flexiblen Materialien und bleibt mindestens eine Woche lang fest an der Maus befestigt und ermöglicht eine komfortable Überwachung der Zeckenfütterung.

Ein Capsule-basiertes Modell für unreife harte Zeckenstadien Befall auf Labormäuse

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Isolierung von microRNAs aus Zeckenspeicheldrüsen und gereinigten extrazellulären Vesikeln. Dies ist ein universelles Verfahren, das häufig verwendete Reagenzien und Verbrauchsmaterialien kombiniert. Die Methode ermöglicht auch die Verwendung einer kleinen Anzahl von Zecken, was zu hochwertigen microRNAs führt, die leicht sequenziert werden können.

Isolierung von microRNAs aus Zecken-Ex-vivo-Speicheldrüsenkulturen und extrazellulären Vesikeln

Hier wird eine Methode vorgestellt, um Zecken in vitro über ein künstliches Membransystem zu ernähren, um eine teilweise oder vollständige Überfüllung einer Vielzahl von Zeckenlebensstadien zu ermöglichen.

Zecken-Fütterung mit künstlicher Membran für Ixodes scapularis

In diesem Artikel wird die Methodik für die Exposition des Menschen gegenüber Larven von Ixodes scapularis für die klinische Forschung vorgestellt. Die Technik ist relativ einfach, für die freiwilligen Forscher tolerierbar und kann je nach experimentellem Bedarf modifiziert werden. Solche Forschungen am Menschen müssen im Rahmen klinischer Studienprotokolle durchgeführt werden, die von den zuständigen Zulassungsbehörden genehmigt wurden.

Ein Modell für die experimentelle Exposition von Menschen gegenüber Larven von Ixodes scapularis Zecken

Hier stellen wir ein Protokoll zur Entnahme von Speichel, Hämolymphe, Speicheldrüsen und Mitteldarm nach der Dissektion einer einzelnen gefütterten Zecke vor, um die gewebespezifische Lokalisierung von durch Zecken übertragenen Krankheitserregern zu untersuchen und das Verständnis der Vektorkompetenz und der Erreger-Mikrobiom-Wechselwirkungen zu verbessern.

Extraktion von Speichel, Hämolymphe, Speicheldrüsen und Mitteldarm aus einzelnen Zecken (Acari: Ixodidae)

Diese Methode beschreibt die Entwicklung eines in vitro durchgeführten Zeckenblutfütringssystems mit einer 3D-gedruckten Kammer und einer im Labor gefertigten Silikonmembran. Das System ermöglicht künstliche Fütterung von Zecken, ermöglicht eine einfache Probenahme in verschiedenen Fütterungsphasen und nutzt geringe Blutmengen und bietet ein unschätzbares Werkzeug zur Untersuchung von Ixodidenzecken.

Zeckenblut, das durch eine künstliche Membran in einer 3D-gedruckten Kammer in der Ixodid-Zeckenforschung fließt

Lernen Sie die RNA-Interferenz in Zecken durch Injektion von doppelsträngiger RNA. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Genfunktionen und biologischen Parametern zur Entwicklung von Kontrollstrategien gegen Zecken.

RNA-Interferenz in Ticks

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