Nicht-reduzierendes SDS PAGE: Eine Methode zur Analyse von Disulfid-verknüpften multimeren Proteinkomplexen

Multimere Proteine werden durch intermolekulare, kovalente Disulfidbindungen zwischen ihren Cysteinresten stabilisiert, was für die Aufrechterhaltung ihrer strukturellen und funktionellen Integrität entscheidend ist.

Um solche Komplexe durch nicht-reduzierende PAGE zu analysieren, nehmen Sie die gewünschte Konzentration von Disulfid-stabilisierten Proteinen. Fügen Sie einen nicht reduzierenden Probenpuffer hinzu und erhitzen Sie die Probe.

Dieser Puffer enthält SDS, das den Proteinen eine insgesamt negative Ladung verleiht, und einen Tracking-Farbstoff, um ihre Bewegung im Gel sichtbar zu machen. Dem Puffer fehlt jegliches Reduktionsmittel, wodurch die Disulfidbindungen unbeeinträchtigt bleiben und der multimere Komplex intakt bleibt.

Laden Sie die einzelnen Komplexe in Vertiefungen des Polyacrylamid-Gels mit dem gewünschten Prozentsatz, die in einer Gelvorrichtung vormontiert sind. Geben Sie eine Proteinleiter bekannter Größe in eine andere Vertiefung. Tauchen Sie die Vertiefungen in einen SDS-basierten Laufpuffer und schließen Sie das Gerät an eine Stromversorgung an.

Der elektrische Strom zwingt die negativ geladenen Proteinkomplexe, sich durch die Poren des Gels in Richtung Anode zu bewegen - dem positiven Anschluss. Da die Proteinkomplexe gleichmäßig negativ geladen sind, erfolgt die Trennung nach Größe, wobei die Multimere an einer bestimmten Stelle eine markante Bande mit höherem Molekulargewicht bilden.

Vergleichen Sie die Größe der abgetrennten Proteinbande mit der Leiter. Das Fehlen von Banden mit niedrigerem Molekulargewicht im Gel bestätigt die erfolgreiche Trennung der intakten multimeren Komplexe.

Bereiten Sie 1 Liter 1X Tris-Glycin-Laufpuffer vor, indem Sie 25 millimolare Tris-, 192 millimolare Glycin- und 0,1 % Gewicht pro Volumen SDS mischen. Richten Sie dann das SDS-PAGE-Laufgerät ein.

Öffnen Sie die 16 % vorgegossene TGX SDS-PAGE-Verpackung gemäß dem Protokoll des Herstellers und entfernen Sie die Kassette. Entfernen Sie den Kamm, der die Vertiefungen auskleidet, und das Klebeband von der Unterseite der Kassette und legen Sie das Gel in das Laufgerät. Füllen Sie die Kammer mit dem 1X-Laufpuffer, bis die Vertiefungen in Flüssigkeit eingetaucht sind.

Spülen Sie die Vertiefungen mit einer Kunststoffpipette mit dem Laufpuffer aus. Laden Sie die Proben zusammen mit 10 Mikrolitern des vorgefärbten Standardmarkers auf das Gel. Lassen Sie das Gel schließlich bei 200 Volt laufen, bis die Farbstofffront etwa 1 Zentimeter vom Boden des Gels entfernt ist.