JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Biologische Techniken
0 Aufrufe • 3:39 Min. • July 8th, 2025
Myosin - ein Motorprotein - hat eine kugelförmige Kopfdomäne, die mit Aktin - einem filamentösen Protein - interagiert. Diese Interaktion ist essentiell für die Translokation von Myosin entlang der Aktinfilamente. Um diese Bindung in vitro zu untersuchen, führen Sie einen invertierten Motilitätsassay von Myosin über oberflächengebundenem Aktin durch.
Bauen Sie zunächst eine Assay-Kammer zusammen, indem Sie ein biotinyliertes Polyethylenglykol-PEG-beschichtetes Deckglas so über einen Objektträger legen, dass die beschichtete Oberfläche nach innen zeigt, wodurch die Oberseite der Kammer entsteht.
Führen Sie eine Lösung, die Avidin - ein Glykoprotein - enthält, durch die Kammer. Avidin bindet mit hoher Affinität an Biotin, was die Aktinadhäsion verbessert. Als nächstes fließen Sie mit Biotin markierte Aktinfilamente ein, die mit einem roten Fluorophor markiert sind. Der Biotin-Ligand bindet an Avidin und immobilisiert die Filamente auf der Deckglasoberfläche.
Fügen Sie schließlich grün fluoreszierende, proteinmarkierte Myosin-5A-Proteine in einen Puffer hinzu, der Adenosintriphosphat- oder ATP-Moleküle enthält. Das zweiköpfige Myosin 5A, das einen nachlaufenden und einen führenden Kopf enthält, interagiert mit den immobilisierten Aktinfilamenten. Der hintere Kopf des Myosins bindet an ein ATP und löst sich vom Aktin.
Die Hydrolyse des ATP erzeugt einen Krafthub, der es dem hinteren Kopf ermöglicht, sich entlang des Filaments an eine Position vor dem führenden Kopf zu binden. Durch aufeinanderfolgende Kraftschläge bewegt sich das Myosin entlang des immobilisierten Aktinfilaments, ohne sich abzulösen.
Zeichnen Sie mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie die Bewegung der grünen Myosinmoleküle auf den roten Aktinfilamenten auf.
Bereiten Sie die Lösungen für den Myosin-5a-Motilitätstest vor und bewahren Sie sie auf Eis auf.
Waschen Sie die Kammer mit 10 Mikrolitern Motilitätspuffer mit DTT. 10 Mikroliter 1 Milligramm pro Milliliter BSA in Motilitätspuffer mit DTT einfließen. Wiederholen Sie dies zweimal und warten Sie eine Minute nach der dritten Wäsche. Verwenden Sie Taschentuch oder Filterpapier, um die Lösung durch den Kanal zu leiten, indem Sie die Ecke des Papiers vorsichtig am Ausgang der Durchflusskammer platzieren.
Waschen Sie dann die Kammer dreimal mit 10 Mikrolitern Motilitätspuffer mit DTT. 10 Mikroliter der NeutrAvidin-Lösung in Motilitätspuffer mit DTT einfließen lassen und eine Minute warten. Waschen Sie dann dreimal mit 10 Mikrolitern dieser Lösung.
10 Mikroliter bRh-Aktin-haltiger Motilitätspuffer mit DTT mit einer Pipettenspitze mit großer Bohrung einfließen lassen und eine Minute warten. Dann dreimal mit 10 Mikrolitern Motilitätspuffer mit DTT waschen.
30 Mikroliter Endpuffer mit 10 nanomolaren Myosin 5a einfließen lassen und sofort auf das Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskop laden. Beginnen Sie mit der Aufnahme, sobald der optimale Fokus für die TIRF-Bildgebung gefunden wurde.