Dissipative Mikrogravimetrie-Technik zur Untersuchung der Protein-Lipid-Doppelschicht-Wechselwirkung

Um die Wechselwirkung zwischen einem Phospholipid-bindenden Protein und einer Lipiddoppelschicht durch dissipative Mikrogravimetrie zu untersuchen, nehmen Sie eine Mikrowaage mit einem Quarzsensor. Beim Anlegen einer geeigneten Spannung schwingt die Quarzschicht, die zwischen zwei Metallelektroden eingebettet ist, mit einer bestimmten Frequenz.

Geben Sie eine Suspension aus kleinen unilamellären Vesikeln – bestehend aus einer einzigen Lipiddoppelschicht – auf den Sensor. Die Vesikel adsorbieren an der mit Siliziumdioxid beschichteten hydrophilen Oberfläche – wodurch die Sensormasse erhöht und die Schwingungsfrequenz proportional verringert wird.

Die mit Puffern gefüllten Vesikel wirken wie eine viskoelastische Schicht, die zur Dissipation führt – der Dämpfung der Schwingung. Die adsorbierten Vesikel platzen und geben den eingeschlossenen Puffer frei. Die daraus resultierende Abnahme der Masse erhöht die Schwingungsfrequenz.

Die geplatzten Vesikel bilden eine durchgehende Doppelschicht, die eine biologische Membran nachahmt. Die Steifigkeit der Doppelschicht verringert die Verlustleistung.

Fügen Sie einen Puffer mit Kalziumionen zusammen mit dem Zielprotein hinzu. Die Kalziumionen binden an das Protein und verändern dessen Konformation – so wird die Bindung an die Lipidmoleküle in der Doppelschicht ermöglicht.

Die Proteinbindung erhöht die Masse des Sensors – was zu einer verringerten Frequenz führt. Die strukturelle Integrität der Doppelschicht bleibt davon unberührt, was zu einer geringfügigen Zunahme der Dissipation führt.

Fügen Sie einen Chelatbildner hinzu, um die Kalziumionen zu chelatisieren und so die Proteine von der Doppelschicht zu trennen.

Das Fehlen von gebundenen Proteinen führt die Frequenz und Dissipation der Oszillation auf das Niveau der nicht-proteingebundenen Werte zurück – was bestätigt, dass die Bindung ausschließlich kalziumabhängig ist und dass die Doppelschicht intakt bleibt.

Docken Sie die plasmagereinigten Sensoren vorsichtig mit einer Pinzette in die vier Strömungskammern ein. Vermeiden Sie jeglichen Druck oder jede Torsion der Kammern und Rohre, die zu Undichtigkeiten führen können. Spülen Sie das System 10 Minuten lang mit Citratpuffer im Open-Flow-Modus.

Starten Sie das Programm. Beginnen Sie mit der Aufzeichnung aller Änderungen der Frequenz und der Verlustleistung des ersten Grundtons und der ersten Obertöne mit der Software, bis die Frequenz- und Verlustbasislinien stabil sind.

Wenn die Basislinien stabil sind, tragen Sie die SUV-Federung in Citratpuffer auf. Entfernen Sie mit einem Reaktionsgefäß 1,5 Milliliter des Totvolumens. Schließen Sie dann das System im Loop-Flow-Modus. Zeichnen Sie die Verschiebung der Frequenzdissipation für weitere 10 Minuten auf.

Wenn der SLB stabil ist, wird das System mit dem laufenden Puffer bei den erforderlichen Kalziumkonzentrationen in einem Open-Flow-Modus für 40 Minuten äquilibriert. Geben Sie das Protein in den kalziumhaltigen Laufpuffer. Führen Sie die Anwendung des Proteins in einem Loop-Flow-Modus durch, bis ein stationärer Gleichgewichtszustand erreicht ist.