Eine In-vitro-Technik zur Untersuchung der Bildung von Inflammasom-Komplexen in Makrophagen

Beginnen Sie mit einer Platte, die eine Kultur mit primären Makrophagen enthält.

Einführung des bakteriellen Lipopolysaccharids, LPS, das an Toll-like-Rezeptoren auf Makrophagen bindet und eine Hochregulierung der Pyrindomäne 3 oder NLRP3 der Proteinfamilie NLR-Familie auslöst.

Fügen Sie ein Ionophor hinzu, das den Ausfluss von Kaliumionen vermittelt. Vermindertes zytosolisches Kalium aktiviert NLRP3. Aktiviertes NLRP3 oligomerisiert und induziert die Rekrutierung eines Adapterproteins, das wiederum Pro-Caspase-1 rekrutiert und ein Inflammasom bildet.

Die Autoproteolyse wandelt Pro-Caspase-1 in aktive Caspase-1 um, die den entzündlichen Zelltod oder die Pyroptose vermittelt. DNA-Schäden während der Pyroptose führen zur Kernkondensation.

Fixieren Sie die Zellen und behandeln Sie sie mit einem Reinigungsmittel, um sie zu permeabilisieren.

Fügen Sie einen primären Antikörper hinzu, der an das Inflammasom-assoziierte Adapterprotein bindet, und einen fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörper, der an den primären Antikörper bindet und das Inflammasom markiert.

Führen Sie eine fluoreszierende Nukleinsäurefärbung ein, um den Zellkern zu markieren. Unter einem Fluoreszenzmikroskop zeigen die Zellen kondensierte Zellkerne - was auf Pyroptose hinweist - und Herde von Adapterproteinen - was auf die Bildung von Inflammasomen hinweist.

Für die immunfluorchemische Analyse der mit Nigericin behandelten Zellen waschen Sie die sondenmarkierten Zellen und inkubieren Sie die Zellen in 250 Mikrolitern Fixierungs- und Permeabilisierungslösung pro Vertiefung für 30 Minuten auf Eis unter Lichtschutz.

Waschen Sie die Makrophagen noch dreimal mit frischem Waschpuffer und markieren Sie die Zellen mit 250 Mikrolitern Primärantikörper gegen Apoptose-assoziiertes speckartiges Protein, das eine C-terminale Caspase-Rekrutierungsdomäne (ASC) enthält, pro Vertiefung für eine Stunde auf Eis.

Waschen Sie die Zellen am Ende der Inkubation und markieren Sie die Proben mit 250 Mikrolitern des entsprechenden Fluoreszenzfarbstoff-konjugierten Sekundärantikörpers für eine weitere Stunde auf Eis, wobei Sie in den letzten 5 Minuten 4 Mikroliter eines geeigneten fluoreszierenden Kernfärbefarbstoffs hinzufügen.

Nachdem Sie die Zellen 3 Mal in Kaltwaschpuffer gewaschen haben, montieren Sie Deckgläser mit 7 Mikrolitern Anti-Fade-Eindeckmedium auf die Objektträger, wie gezeigt, und bilden Sie die Makrophagen durch konfokale Fluoreszenzmikroskopie ab.