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Immunologie
0 Aufrufe • 3:56 Min. • July 8th, 2025
Nehmen wir eine menschliche Leberkrebs-Zellkultur, die genetisch so verändert wurde, dass sie Natriumtaurocholat exprimiert, das Polypeptid oder NTCP mittransportiert – einen Transmembranrezeptor.
Fügen Sie das rekombinante Hepatitis-B-Virus oder HBV hinzu. Das Virus besteht aus einer äußeren Hülle, die Oberflächenproteine enthält, und einem inneren Nukleokapsid, das das Genom umschließt. Die Einfügung eines Luciferase-Reportergens hemmt die Fortpflanzungsfähigkeit des Virus.
Das virale Hüllprotein bindet an den NTCP-Rezeptor der Wirtszelle.
NTCP interagiert mit dem epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor EGFR und oligomerisiert, wodurch eine EGFR-vermittelte Endozytose des Virus induziert wird.
Die Virushülle verschmilzt mit der Endosomenmembran, um das Nukleokapsid freizusetzen, das sich am Kernporenkomplex zersetzt.
Das virale Genom dringt in den Zellkern ein und wandelt sich in kovalent geschlossene zirkuläre DNA oder cccDNA um – eine stabile Matrize – die für virale Proteine, einschließlich Luciferase, kodiert.
Ernten Sie die Zellen in vordefinierten Intervallen und lysieren Sie, um intrazelluläre Luziferase freizusetzen.
Führen Sie ein Reportersubstrat ein. Luciferase oxidiert das Substrat und erzeugt ein Signal.
Ein Anstieg der Luciferase-Aktivität nach der Infektion deutet auf eine kontinuierliche Expression des viralen Genoms hin.
Platten-HepG2-Zellen, die stabil Natriumtaurocholat exprimieren, co-transportierendes Polypeptid oder NTCP sind, die anfällig für eine HBV-Infektion sind, und inkubieren bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2.
Einen Tag vor der Infektion werden ca. 5 x 104 HepG2/NTCP-Zellen in 0,1 Milliliter Kulturmedium in die Vertiefungen einer 96-Well-Kollagen-beschichteten Platte eingefüllt. Tauen Sie rekombinantes HPV in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad auf, bis ein kleines Stück Eis im Fläschchen verbleibt.
Bereiten Sie das Medium für die Infektion vor, indem Sie 78 Mikroliter frisches Nährmedium, zwei Mikroliter DMSO, 10 Mikroliter mit 40 % PEG8000 in 1X PBS und 10 Mikroliter rekombinantes HPV kombinieren. Geben Sie 100 Mikroliter rekombinante HBV-Lösung in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte.
Verwenden Sie einen Tag nach der Infektion 300 Mikroliter PBS, um die Zelle dreimal zu waschen, um das kontaminierende Reporterprotein aus der Virusfraktion zu entfernen. Geben Sie 200 Mikroliter Kulturmedium mit 2 % DMSO zu den infizierten Zellen und inkubieren Sie eine Woche oder weniger.
Um eine Analyse der HBV-Infektion durchzuführen, verwenden Sie PBS, um die infizierten Zellen dreimal zu waschen. Geben Sie 50 Mikroliter Lysepuffer zu den infizierten Zellen. Schütteln Sie die Kulturplatte fünf Minuten lang und zentrifugieren Sie sie dann fünf Minuten lang bei 2000 mal g. Geben Sie 50 Mikroliter des Reportersubstrats auf eine Luminometerplatte, geben Sie dann 20 Mikroliter des Zelllysats auf die Platte und mischen Sie durch kurzes Schütteln. Setzen Sie abschließend die Platte in das Luminometer ein und starten Sie die Ablesung.