Beurteilung von internalisiertem Porphyromonas gingivalis in Endothelzellen des Wirts

Bei einer Infektion mit Porphyromonas gingivalis binden die Fimbrien der anaeroben Bakterien an spezifische Rezeptoren auf den Wirtszellen.

Diese Bindung löst intrazelluläre Signalkaskaden aus, die zu einer Umlagerung des Aktins und einer bakteriellen Internalisierung in den Phagosomen führen.

Um das Überleben von internalisiertem Porphyromonas gingivalis in Endothelzellen in vitro zu beurteilen, nehmen Sie eine Multi-Well-Platte mit Endothelzellen, die auf Deckgläser geklebt sind.

Fügen Sie Porphyromonas gingivalis Suspension hinzu. Inkubieren, um die bakterielle Internalisierung zu erleichtern.

Entfernen Sie das Medium und waschen Sie es mit einem anaeroben Puffer, um nicht internalisierte Bakterien zu entfernen.

Fügen Sie Medien hinzu, die Antibiotika enthalten, die für die Endothelzellen undurchlässig sind, um die an der Oberfläche anhaftenden Bakterien zu eliminieren.

Inkubieren Sie mit einem milden Tensid, um die Endothelzellen zu lysieren und die Bakterien freizusetzen, ohne ihre Lyse zu verursachen.

Verdünnen Sie das gesammelte Lysat mit einem Medium. Bereiten Sie serielle Verdünnungen des Lysats vor.

Plattieren Sie die Verdünnungen auf Blutagarplatten. Inkubieren Sie unter anaeroben Bedingungen, damit Porphyromonas gingivalis wächst und sichtbare Kolonien bildet.

Zählen Sie die Kolonien, um die Fähigkeit von Porphyromonas gingivalis zu beurteilen, in Endothelzellen einzudringen und darin zu überleben.

Nach der Infektion der HUVEC-Zellen werden die Zellen dreimal mit anaerobem PBS gewaschen. Als nächstes fügen Sie den HUVEC-Zellen 2 Milliliter VEGF-Medium hinzu, das mit voroptimierten Antibiotikakonzentrationen ergänzt ist. Inkubieren Sie die Zellen eine Stunde lang. Aspirieren Sie das Medium und geben Sie 2 Milliliter 1%ige Saponinlösung in BHI in jede Vertiefung. 15 Minuten inkubieren.

Kratzen Sie anschließend die lysierten Zellen ab und sammeln Sie das Lysat in einem Zentrifugenröhrchen. Verdünnen Sie das Lysat 1 zu 1 mit BHI-Medium und bereiten Sie dann serielle Verdünnungen ab 1 bis 100 vor. 200 Mikroliter der geeigneten Konzentrationen auf Blut-Agar-Platten auffüllen. Lassen Sie die Bakterien sieben Tage lang in einer anaeroben Kammer wachsen und zählen Sie dann die Kolonien.