Generierung neuraler Vorläuferzellen aus embryonalen Stammzellen in serumfreien Monolayer-Kulturen

Beginnen Sie mit einer Kultur von embryonalen Stammzellen der Maus.

Waschen Sie die Zellen mit einem Puffer, um Medien und Zellreste zu entfernen.

Es wird ein Enzymcocktail hinzugefügt, um Zellen von der Kolbenoberfläche zu lösen.

Fügen Sie Medien hinzu, um die enzymatische Aktivität zu stoppen, und sammeln Sie die Zellen in einem Röhrchen. Zentrifugieren Sie und verwerfen Sie den Überstand, der die Enzyme enthält.

Resuspendieren Sie die Zellen in serumfreien neuronalen Kulturmedien.

Aussaat der Zellen in gelatinebeschichtete Multi-Well-Platten-Wells.

ausbrüten. Die embryonalen Stammzellen haften an der mit Gelatine überzogenen Oberfläche. Medienbestandteile wie Nährstoffe, Wachstumsfaktoren und Hormone erleichtern die Zellproliferation und bilden eine Monoschicht.

Bei dieser Zelldichte produzieren und setzen die embryonalen Stammzellen optimale Mengen an Wachstumsfaktoren und Zytokinen frei.

Diese Moleküle lösen intrazelluläre Signalwege aus und erleichtern so die Differenzierung embryonaler Stammzellen in neurale Vorläuferzellen.

Mischen Sie die Gelatine mit 500 Millilitern warmem PBS und bedecken Sie den Boden des Zellkulturbehälters mit gerade so viel Lösung, dass die Oberfläche bedeckt ist. Während die Gelatine bedeckt ist, spülen Sie die subkonfluente Kultur der embryonalen Stammzellen der Maus zweimal in PBS ab. Geben Sie dann 1 Milliliter Dissoziationsreagenz in die Kultur.

Nach zwei bis fünf Minuten klopfen Sie auf das Gefäß, um die Monoschicht in eine Einzelzellsuspension zu lösen, und sammeln Sie die Kultur in insgesamt 10 Millilitern Medium und Zelldissoziationsreagenz.

Übertragen Sie die Zellen in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen und schleudern Sie sie in einer Zentrifuge herunter. Nach sorgfältiger Aspiration des Überstands wird das Pellet in 10 Millilitern vorgewärmtem N2B27 resuspendiert, indem es gegen die Seite des Röhrchens pipetiert wird, um Blasenbildung zu vermeiden.

Zählen Sie nun die Zellen, indem Sie die Konzentration aufzeichnen, und resuspendieren Sie sie in der entsprechenden Anzahl von Zellen pro Volumeneinheit pro Vertiefung in vorgewärmtem N2B27 gemäß der Tabelle. Aspirieren Sie dann die Gelatine aus dem Kulturgefäß und beschichten Sie die Zellen, ohne den Behälter zu verwirbeln.

Stellen Sie die Kulturen in einen feuchten Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid und ersetzen Sie das Medium alle ein bis zwei Tage durch frisches N2B27.