Eine In-vitro-Methode zur Erzeugung von Organoiden des menschlichen Gehirns

Beginnen Sie mit einer Kultur von Neurosphären, frei schwebenden Clustern von neuroepithelialen Vorläuferzellen.

Übertragen Sie diese Neurosphären auf ein Einbettblatt.

Entfernen von Medien. Geben Sie einen Tropfen extrazelluläre Membranmatrix, die Proteine und Wachstumsfaktoren enthält, zu jeder Neurosphäre.

Inkubieren Sie, damit sich die Matrix verfestigt und die Neurosphären darin einbettet.

Übertragen Sie nun die in die Matrix eingebetteten Neurosphären mit Neurosphärenmedien auf eine Kulturplatte, die Neurosphärenmedien enthält.

ausbrüten. Die extrazelluläre Membranmatrix und ihre Bestandteile erleichtern die Differenzierung der neuroepithelialen Vorläuferzellen in neuroepitheliale Zellen, die sich vermehren und flüssigkeitsgefüllte Lumen bilden.

Übertragen Sie die Neurosphären nach der Inkubation in einen Spinnerkolben, der vorgewärmte Organoidmedien des Gehirns enthält. Inkubieren Sie unter Rühren, um die Sauerstoff- und Nährstoffdiffusion zu verbessern und das Zellwachstum zu fördern.

Wachstumsfaktoren und niedermolekulare Inhibitoren in Medien fördern die neuronale Differenzierung und entwickeln sich zu Zellen bestimmter Hirnregionen, die reife Hirnorganoide bilden.

Um diesen Vorgang zu beginnen, sammeln Sie die Neurosphären mit einer 200-Mikroliter-Mikropipette mit einer 2-Millimeter-Spitze, die zuvor mit einer sterilen Schere geschnitten wurde. Legen Sie dann die Neurosphären in einem Abstand von etwa 5 Millimetern zueinander auf einen Paraffinfilm in einer 100-Millimeter-Schale und entfernen Sie vorsichtig so viel wie möglich vom restlichen Medium. Geben Sie dann einen Tropfen EHS-Matrix auf jede einzelne Neurosphäre.

Inkubieren Sie die EHS-Matrixtropfen mit den Neurosphären für 15 Minuten bei 37 Grad Celsius. Waschen Sie danach die Neurosphären vorsichtig vom Paraffinfilm, indem Sie sie mit Neurosphärenmedium spülen. Inkubieren Sie die Neurosphären anschließend für die nächsten vier Tage und fügen Sie am zweiten Tag 2 Milliliter frisches Neurosphärenmedium hinzu.

Bei diesem Verfahren werden 100 Milliliter organoides Medium des Gehirns durch die Seitenarme in jeden Spinnerkolben gegeben und das Medium im Inkubator mindestens 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius vorgewärmt. Stellen Sie dann sicher, dass die Neurosphären alle getrennt sind. Wenn zwei oder mehr durch die EHS-Matrix verbunden sind, trennen Sie sie, indem Sie die Verbindungsmatrix mit einem Skalpell durchschneiden.

Stellen Sie ein Rührprogramm mit 25 U/min ein. Übertragen Sie die in die EHS-Matrix eingebetteten Neurosphären vorsichtig in die Spinnerkolben mit 100 Millilitern Organoidmedium. Stellen Sie anschließend die Spinnerkolben für 14 Tage bei 37 Grad Celsius auf eine magnetische Rührplattform in den Inkubator. Dies ist der Tag Null der Organoidkultur. Wechseln Sie das Medium einmal pro Woche, indem Sie die Hälfte des Mediums entfernen und die gleiche Menge frisches Medium hinzufügen.