JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Neurowissenschaften
0 Aufrufe • 3:58 Min. • July 8th, 2025
Beginnen Sie mit einer adhärenten Kultur von Knochenmarkstromazellen.
Setzen Sie die Zellen für eine erforderliche Dauer Hypoxie aus, einem Zustand, der durch einen reduzierten Sauerstoffgehalt gekennzeichnet ist.
Isolieren Sie die Hypoxie-vorkonditionierten Zellen, zentrifugieren Sie dann und entfernen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie die Zellen in neuronalen Vorläufermedien, die neuronale Wachstumsfaktoren enthalten.
Übertragen Sie die Zellen in eine Kulturplatte mit geringer Bindung und inkubieren Sie.
Hypoxie-Präkonditionierung und neuronale Wachstumsfaktoren induzieren die Differenzierung von Stromazellen in neuronale Vorläuferzellen.
Die Oberfläche der niedrig anhaftenden Platte hält die Vorläuferzellen in Suspension, was ihre Proliferation und Aggregation zu dreidimensionalen Neurosphären erleichtert.
Entnehmen Sie die Neurosphären, zentrifugieren Sie und entfernen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie die Zellen in glialen Induktionsmedien, die gliaspezifische Wachstumsfaktoren enthalten.
Übertragen Sie die Neurosphären auf eine Kulturplatte, die mit Laminin, einer extrazellulären Matrixkomponente, und Poly-D-Lysin, einem positiv geladenen synthetischen Polymer, beschichtet ist.
Die beschichtete Oberfläche fördert die Zelladhäsion und erleichtert die Anheftung von Neurosphären.
Die gliaspezifischen Wachstumsfaktoren stimulieren die Differenzierung der neuronalen Vorläuferzellen in Schwann-Zell-ähnliche Zellen, die die charakteristische konische Morphologie der Schwann-Zellen aufweisen.
Für eine hypoxische Vorkonditionierung lösen Sie zunächst die Ringklemme und reinigen die freiliegenden Teile mit 70% Ethanol. Zerlegen Sie außerdem die Hypoxiekammer in Komponenten und legen Sie sie zur Sterilisation unter UV-Licht für 15 Minuten in eine Laminar-Flow-Haube.
Waschen Sie anschließend eine 80 % bis 90 % konfluente MSC-Kultur, wie gerade gezeigt, mit 10 Millilitern PBS und behandeln Sie die Kulturen mit frischem MSC-Wachstumsmedium, das mit 25 Millimolar HEPES ergänzt wird. Legen Sie die behandelte Kultur in die wieder zusammengesetzte Hypoxiekammer und ziehen Sie die Ringklemme fest. Versiegeln Sie die Verbindungsenden der Kammer, um sicherzustellen, dass kein Gas austritt, und spülen Sie ein Gasgemisch aus 99 % Stickstoff und 1 % Sauerstoff mit einer Durchflussrate von 10 Litern pro Minute in die Kammer.
Stellen Sie die Kammer nach fünf Minuten für 16 Stunden in den Zellkultur-Inkubator. Am nächsten Morgen lösen Sie die Zellen wie eben gezeigt und sammeln sie durch Zentrifugation. Resuspendieren Sie das Pellet in neuronalem Vorläufermedium und säen Sie 6 x 103 Zellen pro Quadratzentimeter auf Sechs-Well-Platten mit geringer Bindung für ihre Kultur bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 für 12 Tage.
Größenhafte, nicht adhärente Zellkugeln sollten bis zum 6. bis 7. Tag beobachtet werden, wobei an den Tagen 10 bis 12 in Hypoxie-konditionierten Kulturen mehr Neurosphären sichtbar waren als in solchen unter Normoxie. Am 12. Tag überführen Sie die Neurosphären mit einer 10-Milliliter-Pipette in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen und sammeln die Neurosphären durch Zentrifugation.
Resuspendieren Sie die Kugeln in DMEM/F12 und plättieren Sie 5 bis 10 Neurosphären pro Quadratzentimeter auf Poly-D-Lysin-beschichtete, beschichtete Sechs-Well-Platten in 1,5 Millilitern glialem Induktionsmedium pro Well. Bewahren Sie die Kugelzellkultur mindestens sieben Tage lang auf und erneuern Sie das Medium alle drei Tage.