JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Neurowissenschaften
0 Aufrufe • 3:09 Min. • July 8th, 2025
Nehmen Sie eine embryonale Stammzellsuspension der Maus.
Zentrifuge, entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in einem neuronalen Differenzierungsmedium.
Tröpfchen der Suspension auf die Innenseite eines Kulturplattendeckels geben.
Fügen Sie der Bodenplatte einen Puffer hinzu, um ein Austrocknen der Tröpfchen zu verhindern. Legen Sie den Deckel auf die Bodenplatte, so dass eine hängende Tropfenkultur entsteht, und inkubieren Sie.
Aufgrund der Schwerkraft gruppieren sich die Zellen und bilden dreidimensionale Aggregate, die als Embryoidkörper oder EBs bezeichnet werden.
Die Tröpfchen werden in eine Platte mit dem Differenzierungsmedium gegeben und unter Rühren für das Wachstum der EBs inkubiert.
Das Medium wird zentrifugiert und entfernt; die EBs werden in dem mit Retinsäure versetzten Differenzierungsmedium resuspendiert, auf eine Kulturplatte überführt und inkubiert.
Retinsäure dringt in die Zellen ein und löst die Bildung eines Transkriptionskomplexes aus. Der Komplex induziert die Genexpression und löst die Differenzierung in neurale Vorläuferzellen aus.
Die differenzierten EBs sind bereit für nachgelagerte Anwendungen.
Beginnen Sie mit dem Einrichten der hängenden Tropfenzellkultur. Für eine 10 Zentimeter große Zellkulturplatte stellen Sie die Konzentration auf 500 Zellen pro 20 Mikroliter Differenzierungsmedium ein. Bereiten Sie genügend Zellsuspension für 50 20-Mikroliter-Tröpfchen vor. Verwenden Sie eine Mikropipette oder eine Repetitionpipette, um 20 Mikroliter Zellsuspension auf den Deckel einer Gewebekulturplatte zu geben, und achten Sie darauf, dass die Tröpfchen nicht zu dicht beieinander liegen, um ein Verschmelzen zu verhindern.
Füllen Sie den Teller mit 5 bis 10 Millilitern PBS und setzen Sie den Deckel vorsichtig wieder auf den Teller. Inkubieren Sie die Kultur im 37 Grad Celsius heißen Inkubator. Nach zwei Tagen sammeln Sie die Tröpfchen vom Deckel und geben Sie sie in eine 10 Zentimeter große Zellkultur-Suspensionsplatte, die mit 10 Millilitern Differenzierungsmedium gefüllt ist. Legen Sie dann die Platte auf einen auf niedrige Geschwindigkeit eingestellten Orbitalschüttler im Inkubator. Nach weiteren zwei Tagen zentrifugieren Sie die Zellen drei Minuten lang bei 200-facher g und entfernen den Überstand.
Um die Differenzierung des Embryoidkörpers in neurale Vorläuferzellen zu induzieren, resuspendieren Sie die Zellen in einem Differenzierungsmedium mit 5-mikromolarer Retinsäure. Inkubieren Sie die Platte zwei Tage lang. Ersetzen Sie dann die Hälfte des Mediums durch frisches Medium, indem Sie die Platte kippen und pipettieren.