Direkte Reprogrammierung von hämatopoetischen Vorläuferzellen in neurale Stammzellen

Beginnen Sie mit einer Zellsuspension aus genetisch veränderten hämatopoetischen Vorläuferzellen.

Diese Zellen exprimieren Transkriptionsfaktoren, die für ihre Reprogrammierung in neurale Stammzellen erforderlich sind. Dieser Vorgang wird als direkte Reprogrammierung bezeichnet.

Übertragen Sie die Zellen auf eine mit extrazellulärer Matrix beschichtete Multiwell-Platte mit einem neuralen Vorläufermedium und inkubieren Sie.

Die extrazelluläre Matrix bildet ein dreidimensionales Gerüst für die Zellansiedlung und das Zellwachstum.

Während der Inkubation initiieren Transkriptionsfaktoren, die von der hämatopoetischen Vorläuferzelle exprimiert werden, eine Abfolge von molekularen Ereignissen, die ihre Umwandlung in eine neurale Stammzelle ermöglichen.

Das neuronale Vorläufermedium enthält Faktoren, die das Überleben induzierter neuraler Stammzellen begünstigen.

Ersetzen Sie dieses Medium nach der Inkubation durch ein frisches neuronales Vorläufermedium, um die Zellvermehrung zu fördern.

Trennen Sie die Zellen mit einem Zellschaber.

Sammeln Sie diese Suspension und übertragen Sie die Zellen in eine Vertiefung mit neuronalem Stammzellmedium.

Inkubieren zur Erhaltung von induzierten neuralen Stammzellen.

Wenn die Zellen zu 30 bis 50 % konfluent sind, aspirieren Sie den Überstand und die Reserve und fügen Sie dann 1 Milliliter neurales Vorläufermedium in jede Vertiefung hinzu. Um eine Stützplatte aus den Kugeln im Überstand herzustellen, zentrifugieren Sie den Reserveüberstand 10 Minuten lang bei 170 g g.

Aspirieren Sie dann den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in neuronalem Vorläufermedium. Platte in einer Matrigel-beschichteten 24-Well-Platte; Wechseln Sie das Medium in jeder Zellplatte jeden zweiten Tag, bis die Zellen eine Konfluenz von 60 % bis 80 % erreichen, normalerweise nach einer Woche.

Sobald die Zellen den erforderlichen Konfluenz erreicht haben, aspirieren Sie den Überstand und fügen Sie 1 Milliliter neurales Stammzellmedium in jede Vertiefung hinzu. Dissoziieren Sie dann die Zellen mit einem Zellschaber, gefolgt von einem sehr sanften Pipettieren.

Übertragen Sie als Nächstes die Zellen aus einer Vertiefung der 24-Well-Platte in eine Vertiefung einer 6-Well-Platte. Geben Sie einen weiteren Milliliter Medium in die Vertiefung und legen Sie die 6-Well-Platte nach Wiederholung des Verfahrens für alle Vertiefungen in den 37 Grad Celsius heißen Inkubator mit 5 % Kohlendioxid.

Wechseln Sie das volle Volumen des Mediums alle zwei Tage, bis die Zellen einen Konfluenzgrad von 60 % erreichen. Dissoziieren Sie die Zellen nach jedem Mal und plattieren sie erneut in einem Verhältnis von 1 zu 3, wie gerade gezeigt.