JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Neurowissenschaften
0 Aufrufe • 2:26 Min. • July 8th, 2025
Nehmen wir humaninduzierte Neuronen oder iNs, die auf einer extrazellulären Matrix kultiviert werden.
Entfernen Sie das Medium und fügen Sie Verdauungsenzyme hinzu, die die Matrix aufbrechen und die Zellen dissoziieren.
Übertragen Sie die iNs in ein Röhrchen. Die Suspension wird zentrifugiert und der Überstand, der die Enzyme enthält, verworfen.
Resuspendieren Sie die iNs in einem Co-Kulturmedium und überführen Sie sie in eine Kultur mit induzierten Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (iOPCs).
iOPCs sind Vorläufer von Oligodendrozyten, die Myelinscheiden um die Axone der Neuronen bilden.
Bei der Inkubation bilden die iOPCs synaptische Verbindungen mit den iNs. Trophische Faktoren, die von den iOPCs freigesetzt werden, und Wachstumsfaktoren im Medium fördern die iN-Reifung zu Neuronen und zeigen vermehrt zelluläre Prozesse, die synaptische Verbindungen mit anderen Neuronen bilden.
Die elektrische Aktivität der reifen Neuronen und Wachstumsfaktoren im Medium induziert die Reifung von iOPC zu Oligodendrozyten.
Die Oligodendrozyten verlängern zelluläre Prozesse und bilden Myelinscheiden um die neuronalen Axone.
Die etablierte Co-Kultur steht für die Analyse bereit.
An Tag 14 werden iOPCs mit einer Dichte von 1 x 105 Zellen pro Well in einer 24-Well-Platte in OPC-Differenzierungsmedium plattiert. Am nächsten Tag lösen Sie die induzierten menschlichen Neuronen mit einer Lösung zur Zellablösung. Fügen Sie Neuronen zu den kultivierten OPCs hinzu und plattieren Sie sie mit einer Sitzdichte von 2 x 105 Zellen pro Well. Verwenden Sie ein Co-Kulturmedium, das neurobasales A-Medium, 2 % B-27-Supplement und 100 Nanogramm pro Milliliter T3-Trijodthyronin enthält. Wechseln Sie das Medium am nächsten Tag und dann jeden zweiten Tag. Wenn sich OPCs zu schnell vermehren und in weniger als drei Tagen die Konfluenz erreichen, fügen Sie 2 bis 5 mikromolare Ara-C hinzu.