JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Neurowissenschaften
0 Aufrufe • 2:16 Min. • July 8th, 2025
Beginnen Sie mit einer Kulturplatte, die mit einem synthetischen Polymer und einem Adhäsionsprotein beschichtet ist.
Fügen Sie neurale Vorläuferzellen des Rückenmarks hinzu, die in einem Motoneuronen-Differenzierungsmedium resuspendiert sind, ergänzt mit einem niedermolekularen Inhibitor.
Die beschichtete Plattenoberfläche erleichtert die Zelladhäsion.
Der niedermolekulare Inhibitor blockiert spezifische Proteinkinasen und verhindert so die zelluläre Apoptose.
Entfernen Sie das verbrauchte Medium und fügen Sie frisches Differenzierungsmedium hinzu.
Das Medium enthält eine Verbindung, die die Differenzierung der neuralen Vorläuferzellen in Motoneuronen-Vorläuferzellen fördert.
Zusätzlich entstehen gliale Vorläuferzellen.
Als nächstes wird das Präparat durch ein Differenzierungsmedium ersetzt, das mit einem DNA-Synthesehemmer ergänzt ist.
Diese Inhibitoren induzieren selektiv DNA-Schäden und Tod in glialen Vorläuferzellen, während sich die Vorläuferzellen der Motoneuronen zu reifen Neuronen differenzieren.
Waschen Sie die Zellen mit Puffer und fügen Sie das Differenzierungsmedium ohne Inhibitoren hinzu, um die Neuronen zu erhalten.
Tauschen Sie das Medium während der Kultivierung regelmäßig aus, um die Nährstoffe wieder aufzufüllen.
Ersetzen Sie zusätzlich das Medium durch ein Medium, das mit Adhäsionsprotein ergänzt ist, um die neuronale Anheftung zu verbessern und eine homogene Motoneuronenkultur zu etablieren.
Wenn die neuralen Vorläuferzellkulturen eingefroren wurden, tauen Sie sie auf. Nach dem Mediumaustausch und der PBS-Spülung, wie im Manuskript beschrieben, wird das Medium durch ein Motoneuron-Differenzierungsmedium gewechselt, das 0,02 mikromolare Cytosin-Arabinoside enthält.
Inkubieren Sie die Zellen dann 48 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid, wenn gliale Vorläuferzellen als einzelne proliferierende flache Zellen unter postmitotischen Motoneuronen-Vorläuferzellen entstehen, die in Zellclustern aggregiert sind. Führen Sie später einen Medienaustausch durch, wie im Manuskript angegeben.