Verbesserung der Stammzelldifferenzierung mit einer transienten DMSO-Behandlung

Beginnen Sie mit einer Multi-Well-Platte, die adhärente humane pluripotente Stammzellen mit der Fähigkeit zur Differenzierung mehrerer Abstammungslinien enthält.

Führen Sie ein Stammzellmedium ein, das Dimethylsulfoxid oder DMSO enthält.

DMSO dringt in die Zellen ein und verhindert das Fortschreiten des Zellzyklus von der Gap-1- oder G1-Phase, einer Anfangsphase des Zellzyklus, zur Synthese- oder S-Phase.

Dadurch entsteht eine einheitliche Population von Zellen in der G1-Phase, wodurch ihre Differenzierungsfähigkeit verbessert wird.

Ersetzen Sie das Medium durch ein nährstoffreiches ektodermales Differenzierungsmedium, das Inhibitoren der BMP- und TGF-β Signalwege enthält.

Diese Inhibitoren binden an spezifische ALK-Rezeptoren auf den Stammzellen, blockieren die BMP- und TGF-β-Signalwege und verhindern deren Differenzierung in Endoderm- und Mesoderm-Vorläufer.

Dies ermöglicht die selektive Differenzierung von G1-gesperrten Stammzellen in ektodermale Vorläufer, die über eine neuronale Differenzierungsfähigkeit verfügen.

Ersetzen Sie das Medium regelmäßig durch ein frisches Medium, um den Nährstoff- und Differenzierungsfaktorspiegel aufrechtzuerhalten und das Überleben der Zellen zu gewährleisten.

Die Zellen werden wie für 2D-Kulturen beschrieben mit DMSO vorbehandelt und Noggin und SP431542 Stammlösungen hergestellt. Bereiten Sie genügend 10 % Knockout-Serumersatz oder KOSR in Knockout-DMEM für drei bis vier Tage Medienwechsel vor. Bereiten Sie ektodermale Differenzierungsmedien her, indem Sie Noggin und SP431542 zu vorgewärmtem KOSR-Knockout-DMEM hinzufügen, wie im Manuskript beschrieben.

Nach der DMSO-Vorbehandlung aspirieren Sie Medien aus den Zellen und fügen Sie 2 Milliliter Differenzierungsmedium in jede Vertiefung hinzu. Lassen Sie die Zellen drei bis vier Tage bei 37 Grad Celsius in einem Kohlendioxid-Inkubator inkubieren und ersetzen Sie täglich Medien durch frische Differenzierungsfaktoren.