JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Neurowissenschaften
0 Aufrufe • 3:10 Min. • July 8th, 2025
Legen Sie eine Mausnetzhaut auf ein angefeuchtetes Zellsieb und mazerieren Sie in kreisenden Bewegungen, um die Netzhautzellen von der extrazellulären Matrix zu trennen.
Füllen Sie das Sieb in ein Auffangröhrchen.
Geben Sie einen Phosphatpuffer und eine Serumlösung in das Sieb, um die Zellen zu waschen und zu sammeln.
Zentrifuge, um die Zellen abzusetzen. Der Überstand wird verworfen und die Zellen werden in einem Phosphatpuffer und einer Serumlösung resuspendiert.
Fügen Sie blockierende Antikörper hinzu, die an Fc-Rezeptoren auf Zellen binden und so eine unspezifische Bindung von Zielantikörpern verhindern.
Fügen Sie als Nächstes fluoreszenzmarkierte und nicht markierte Primärantikörper hinzu, die an spezifische Zelloberflächenmarker auf verschiedenen Zelltypen binden.
Waschen, um ungebundene Antikörper zu entfernen.
Fügen Sie einen fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörper hinzu, um an den nicht markierten Primärantikörper zu binden.
Waschen, um ungebundene Antikörper zu entfernen.
Führen Sie eine fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) durch, um die unterschiedlichen Fluoreszenzsignale der markierten Zellen zu erfassen und die retinalen Ganglienzellen aus verschiedenen retinalen Zellpopulationen zu sortieren.
Legen Sie bis zu 12 Netzhäute auf ein steriles 70-Mikron-Nylonsieb, das mit PBS und FBS angefeuchtet ist, und mazerieren Sie die Netzhaut vorsichtig mit dem hinteren Ende eines 10-Milliliter-Spritzenkolbens in kreisenden Bewegungen. Wenn alle Zellen dissoziiert wurden, legen Sie das Sieb über ein Sammelröhrchen aus Polypropylen und filtrieren Sie die Zellen mit einer P1000-Pipette durch das Sieb in das Sammelröhrchen.
Spülen Sie das Sieb mit PBS und FBS und sammeln Sie die Wäsche im Auffangröhrchen. Fügen Sie genügend PBS plus FBS hinzu, um das endgültige Volumen auf 1 Milliliter Lösung pro Netzhaut zu erhöhen, und sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation. Resuspendieren Sie dann das Pellet in PBS plus FBS bei einer Konzentration von 1 Milliliter Medium pro 5 Retinae. Blockieren Sie anschließend jede unspezifische FC-Rezeptorbindung in jedem Röhrchen mit 1 Mikroliter Anti-Maus-CD16/32-Antikörper pro 1 x 106 Zellen für 10 Minuten bei Raumtemperatur.
Am Ende der Blockierungsinkubation geben Sie den gewünschten Antikörpercocktail durch sanftes Pipettieren in die Zellen für eine 30-minütige Inkubation auf lichtgeschütztem Eis. Waschen Sie dann die Zellen zweimal in einem Endvolumen von 4 Millilitern PBS und FBS. Markieren Sie die Zellen für weitere 30 Minuten auf lichtgeschütztem Eis mit einem geeigneten Sekundärantikörper, gefolgt von 2 Waschgängen in PBS plus FBS, und laden Sie das Probenröhrchen auf das Durchflusszytometer.