Name: Protokoll für die direkte Umwandlung von murinen embryonalen Fibroblasten in Trophoblast Stammzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Lernen Sie die direkte Umwandlung muriner embryonaler Fibroblasten in Trophoblast-Stammzellen durch transiente Überexpression spezifischer Transkriptionsfaktoren. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung embryonaler und extraembryonaler Differenzierungswege.

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AZ 84-02.04.2013: Alle Maus-Experimente wurden mit der Zustimmung der lokalen institutionellen Tierpflegegremien (Landes fuer Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, Nordrhein-Westfalen [Zulassungs ID-Nummer nach dem deutschen Gesetz des Tierschutzes und im Einvernehmen durchgeführt .A428]). 1. Medienvorbereitung <ol><li> Bereiten 293T-Medium: Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM), 10% (v / v) FBS, L-Glutamin (2 mM), Natriumpyruvat (1 mM), Penicillin / Streptomycin (1x). </li><li> Bereiten MEF Medium: DMEM, 10% (v / v) FBS, L-Glutamin (2 mM), 1x nicht-essentiellen Aminosäuren, Penicillin / Streptomycin (1x). </li><li> Bereiten TS-Medium (w / o FGF4 / Heparin): Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) 1640, 20% (v / v) FBS (Stammzellkultur-Qualität), Penicillin / Streptomycin (1x), L-Glutamin (2 mM ), Natriumpyruvat (1 mM), 2-Mercaptoethanol (0,1 mM). </li><li> Bereiten Sie TS-Medium mit FGF4 / Heparin (TS + F4H): RPMI 1640, 20% (v / v) FBS (StammzellKulturqualität), Penicillin / Streptomycin (1x), L-Glutamin (2 mM), Natriumpyruvat (1 mM), 2-Mercaptoethanol (0,1 mM), 25 ng / ml FGF4, 1 &amp; mgr; g / ml Heparin. Anmerkung: FGF4 und Heparin werden direkt in die Medien unmittelbar vor der Verwendung hinzugefügt. </li><li> Vorbereitung TS-CM mit FGF4 / Heparin (TS-CM + F4H): 70% MEF Anlage TS Medium + 30% frisch hergestellten TS-Medium + 25 ng / ml FGF4, 1 &amp; mgr; g / ml Heparin. Anmerkung: FGF4 und Heparin werden direkt in die Medien unmittelbar vor der Verwendung hinzugefügt. </li><li> Bereiten Sie Transfektionsmediums: Erweiterte DMEM, 2% (v / v) FBS (Stammzellkulturqualität), L-Glutamin (2 mM), Penicillin / Streptomycin (1x). </li><li> Bereiten Sie Virus-Produktionsmedium: Erweiterte DMEM, 5% (v / v) FBS (Stammzellkulturqualität), L-Glutamin (2 mM), Penicillin / Streptomycin (1x). </li></ol> 2. murine embryonale Fibroblasten-Ableitung <ol><li> Set timed Paarungen wt 129S2SV Frauen mit und homozygote männlichen R26 :: rtTA Mäuse (Stamm Name; B6.Cg-Gt (ROSA) 26Sor tm1 (rtTA* M2) Jae / J 7). Am E13.5 Opfer Mäuse durch Genickbruch und zu isolieren primären murinen embryonalen Fibroblasten (MEF) nach Standardprotokollen 8. Danach Platte Zellen aus einem Embryo auf einem 150-mm-Schale in MEF-Medien. </li><li> Sobald primäre MEF Kulturen Konfluenz auf 150-mm-Schalen erreichen, waschen Sie die Zellen zweimal mit 10 ml PBS und 4 ml 0,05% Trypsin / EDTA-Lösung. Inkubieren Geschirr für 3 bis 4 min in den Inkubator bei 37 ° C. </li><li> Nach der Inkubation zu überprüfen, ob Zellen von der Schale abgelöst einem inversen Mikroskop (mit einem 10fach-Objektiv) verwendet wird. 5 ml MEF Medien Trypsinierung zu stoppen und Zellsuspension in einem 50 ml konischen Röhrchen sammeln. </li><li> Pool Zellsuspension aus mehreren Gerichten und sammeln in einem 50 ml konischen Röhrchen. Zentrifuge Zellsuspension für 3 min bei 200 xg und 10 ° C. </li><li> Überstand verwerfen und resuspendieren Zellpellet in FBS, enthaltend 10% (v / v) Dimethylsulfoxid. Frieren MEFs in Aliquots für die weitere Verwendung. Hinweis: Alternativ können Sie auch Wildtype primäre MEFs; jedoch muss eine zusätzliche lentiviralen Vektor exprimierenden rtTA zusammen mit den anderen lentiviralen Vektoren transduziert werden (zum Beispiel unter Verwendung des FUdeltaGW-rtTA Plasmid durch Maherali et al. 9). </li><li> Herstellung von MEF Anlage TS - Medium Hinweis: Vor der Umwandlung Experimente, MEF Anlage (CM) TS Medien vorbereitet werden muss, die für die Subkultur der einzelnen ITSC Linien erforderlich ist (beschrieben in Abschnitt 6). <ol><li> Plate 1 x 10 7 mitotisch inaktivierten MEF pro 150 - mm - Schale in MEF Medium auf gewünschte Anzahl an Gerichten. Inaktivieren MEFs durch γ-Bestrahlung mit einer Dosis von 9 Gy. Hinweis: Die Ausbeute pro 150 mm Schale ca. 60 ml CM ist. </li><li> Der Tag nach der Plattierung, absaugen und MEF Medium verwerfen und 20 ml hinzufügen frisch TS-Medium hergestellt (ohne FGF4 / Heparin) auf jede Schale von mitotisch inaktivierten MEF und Ort Gerichte wieder in den Inkubator bei 37 ° C. </li><li> Nach InkubationTS-Medium für drei Tage auf mitotisch inaktivierten MEF, sammeln Medium in 50 ml konischen Röhrchen. Filtermedium durch ein 0,2-um-Filter und fahren Sie mit 2.6.4. Ersetzen CM mit 20 ml frischem Medium TS zur Herstellung einer weiteren Charge von CM. Hinweis: Mitotisch inaktivierten MEF für CM Vorbereitung bis zu drei Mal verwendet werden. </li><li> Aliquotieren 35 ml gefiltertes CM in 50 ml konischen Röhrchen und bei -20 ° C bis benötigt. Nach dem Auftauen 15 ml frisch hergestellten TS-Medium um 70% TS-CM und lagern bei 4 ° C zu erhalten, für bis zu einem Monat. </li></ol></li></ol> 3. Lentivirale Vector Produktion in 293T-Zellen Hinweis: Alle Schritte werden im Laborraum zu Biosafety Level lizenziert 2 durchgeführt. <ol><li> Vor der Umwandlung Experimente, lentivirale Vektoren für die Doxycyclin (DOX) abhängig Überexpression von Tfap2c, Gata3, Eomes, Ets2 und mCherry vorzubereiten. Für jede Lentiviren, Co-transfizieren mit 293T-Zellen diejeweiligen lentiviralen Transfervektor zusammen mit einem Verpackungs Plasmid und einem VSV-G-exprimierenden Plasmid Hülle (für Informationen Plasmid zu den Materialien siehe Tabelle). Hinweis: Für hilfreiche Informationen in Bezug auf die Produktion Virus Gavrilescu beziehen et al . 10. Obwohl es Retro Produktion beschreibt auch, allgemeine Bemerkungen in Bezug auf Qualität von 293T-Zellen und Plasmid-DNA sind wahr für Lentiviren Produktion. VORSICHT: Geeignete Sicherheitsmaßnahmen getroffen werden müssen, wenn sie mit lentiviralen Vektoren und Arbeit Arbeit hat in einem Biosafety Level 2-Anlage durchgeführt werden. </li><li> Coat fünf 100 mm-Schalen mit Poly-L-Lysin (100 &amp; mgr; g / ml) Lösung, die durch Abdecken der Gerichte mit 5 ml der Lösung und Schaukel sanft Beschichtungslösung gleichmäßig verteilen. Die Schalen werden wieder in den Inkubator bei 37 ° C für 30 min. Nach 30 absaugen Beschichtungslösung min und spülen Geschirr einmal mit PBS. </li><li> Tafel 7 x 10 6 293T Zellen pro Schale in 10 ml 293T-Zellmedien, swirl Gerichte gleichmäßig Zellen und Platz Gerichte wieder in den Inkubator bei 37 ° C zu verteilen. </li><li> Am nächsten Morgen, Wachstumsmedium mit 5 ml Transfektionsmediums ersetzen. In 6 ul einer 1,000x Lager von Chloroquin-Lösung (25 mM) und Platz Gerichte wieder in den Inkubator bei 37 ° C. </li><li> Inzwischen bereiten Transfektionsgemischs: <ol><li> Für jeden lentiviralen Vektor zwei 5 ml Reaktionsgefäße herzustellen, die mit A und B. </li><li> In 600 ul 2x HEPES-gepufferte Salzlösung (HBS) auf das Rohr A. </li><li> In Rohr B - Mix 61,5 ul CaCl 2 - Lösung (2 M), mit 18,5 ug lentivector DNA und 9,25 ug psPAX2 und 9,25 ug pMD2.G. Stellen Sie die Lautstärke auf 600 &amp; mgr; l mit sterilem Kulturqualität H 2 O. </li><li> In Lösung von Rohr B tropfenweise zu Rohr A während verwirbelt. Inkubieren Transfektion Mischung 15 min bei RT. </li></ol></li><li> In Transfektionsgemischs fallen sehr sorgfältig weise auf die vorbereiteten 293T-Zellen auf der 100-mm-Schale. EINfter 5 bis 6 h entfernen Medium und ersetzen mit 10 ml Virus-Produktionsmedium. Platzieren Geschirr wieder in den Inkubator bei 37 ° C. Hinweis: Seien Sie vorsichtig beim Entfernen und Ersetzen Medium, da leicht 293T-Zellen aus der Schale lösen. Medienwechsel 5-6 Stunden nach der Transfektion ist von entscheidender Bedeutung, da längere Exposition gegenüber Chloroquin auf die Zellen toxisch ist. </li><li> Am nächsten Morgen, sorgfältig entfernen und zu entsorgen Medium und mit 7 ml Virus-Produktionsmedium ersetzen. </li><li> Am nächsten Morgen ernten die erste Charge von virushaltigen Medium. Absaugen Medium und sammeln sich in einem 15 ml konischen Röhrchen. Wieder 7 ml Virus-Produktionsmedium auf die Zellen hinzufügen. Shop virushaltige Medium im Kühlschrank, bis die zweite Partie am folgenden Tag geerntet wird. </li><li> Am nächsten Morgen die zweite Charge von virushaltige Medium absaugen es zu den 15 ml konischen Röhrchen, das die erste Partie Zugabe. 293T-Zellen können nun verworfen. Filter virushaltige Medium durch einen 0,45 &amp; mgr; m surfactant freie Celluloseacetat -Membran Filter. Aliquot filtriert, virushaltige Medium und bei -80 ° C zur weiteren Verwendung. Anmerkung: Die Virusproduktion kann auch in 6-Well-Platten durchgeführt werden. Nach unten skalieren Volumen und Zellzahlen entsprechend. </li></ol> 4. Fibroblast Transduction mit 4 Faktoren und mCherry Steuervektor Hinweis: Alle Schritte werden in einem Biosafety Level 2-Anlage durchgeführt. <ol><li> Für eine schematische Darstellung der experimentellen Umriss siehe Abbildung 1. Auftauen eine aliquote Menge von primären rtTA-MEFs und 3,33 x 10 5 Zellen pro Vertiefung einer 6-Well - Platte in einem Gesamtvolumen von 2 ml MEF Medien plattieren. Bereiten Sie mindestens 3 Vertiefungen und beschriften mit 4 Faktoren (4F), mCherry und Kontrolle. Hinweis: Alternativ können Wildtyp-MEFs verwendet werden, wenn ein rtTA exprimierenden lentiviralen Vektor zur lentivector Cocktail während 4,2 Schritt hinzugefügt wird. </li><li> Am folgenden Tag, nachdem die Zellen vollständig von cryopre erholtservation Ersetzen MEF Medien in den drei 6-wells mit 0,6 ml (4F), 0,9 ml (mCherry) und 1 ml (Kontrolle) von Transduction Medien, respectively. Tauen Sie eine aliquote Menge von PLV-tetO-Tfap2c, -Gata3, -Eomes, ets und -mCherry Virus bei RT und fügen 100 ul jeder Virus enthaltenden Überstand (Tfap2c, Gata3, Eomes, Ets2) in den 4F gut. Hinweis: Bei Wildtyp-MEFs, reduzieren Volumen von vorplattiertes Medien von 100 &amp; mgr; l und fügen Sie zusätzlich 100 ul FUdeltaGW-rtTA Virus auf das 4F Mischung enthaltende Überstand. </li><li> 100 l mCherry virushaltigen Medien auf die gut mit mCherry gekennzeichnet. Hinzufügen Polybren bis zu einer Endkonzentration von 8 &amp; mgr; g / ml in jede Vertiefung. Die Schale wieder in den Inkubator bei 37 ° C und Inkubation MEFs O / N mit virushaltigen Überstand. Hinweis: Bei Wildtyp-MEFs, reduzieren Volumen von vorplattiertes Medien von 100 &amp; mgr; l und fügen Sie zusätzlich 100 ul FUdeltaGW-rtTA virushaltige Überstand. </li><li> Am nächsten Morgen, sorgfältig entfernenvirushaltigen Medien und wasche dreimal mit 2 ml PBS. Schließlich 2 ml TS-Medien (ohne FGF4 / Heparin). Anmerkung: Transduzierte MEFs kann entweder direkt zur ITSC Induktionsexperimente verwendet werden, oder zur weiteren Verwendung eingefroren. </li></ol> 5. Fibroblast zu ITSC Conversion Hinweis: Alle Schritte werden im Laborraum zu Biosafety Level lizenziert 2 durchgeführt. <ol><li> Waschen Sie transduzierten MEFs zweimal mit 2 ml PBS und nach Zugabe von 0,5 ml Trypsin / EDTA-Lösung sie im Inkubator inkubieren 3-4 min. Überprüfen Sie unter einem inversen Mikroskop für die ordnungsgemäße Ablösung der Zellen. <ol><li> Inactivate Trypsin von 1 ml Medium TS Zugabe. Übertragen die Zellsuspension in ein 15 ml konisches Röhrchen und zentrifugieren für 3 min bei 200 x g. Überstand verwerfen und Resuspendieren der Zellen in 2 ml TS-Medium. Verwenden Sie die untransduzierten Kontrollprobe, die Zellen zu zählen. </li><li> Platte 4F-MEFs, mCherry-MEFs und untransduzierten Steuer MEFs jeweils in einer Dichte von 2 x 10 &amp; sup5 ;Zellen pro 100 mm Zellkulturschale in 10 ml TS-Medium, enthaltend 2 &amp; mgr; g / ml dox (TS-Medium + FGF4 / Heparin + DOX). </li><li> Alternativ führen transdifferentiation auf kleinere Gerichte. Platte 3,6 x 10 3 Zellen pro cm 2 auf gewünschte Schale Größe, Umfang Volumen entsprechend. </li></ol></li><li> Am nächsten Tag, ein Epifluoreszenz-Mikroskop (mit einem 10fach-Objektiv und einen Filter geeignet für rote Fluoreszenzanregung) überwachen die Expression von mCherry Protein um Transduktionseffizienz zu schätzen. Hinweis: Transduktionswirksamkeit sollte auf 100% betragen. Wenn erhöhte Zelltod nach Transgen Induktion offensichtlich ist bedeutet dies, dass Virus-Titer zu hoch war. Transduktion sollte mit verringerter Menge an Virus-haltigem Medium wiederholt werden. </li><li> Von nun an Wechselmedien auf allen Plattierung jeden zweiten Tag bis zum Tag 10 nach der Gerichte. Danach füttern Zellen mit TS-Medium ohne DOX (TS-Medium + FGF4 / Heparin). </li><li> Unter Verwendung eines invertierten Mikroskops Monitor fürAussehen von &#39;transdifferentiated Gebiete &quot;auf 4F Schale (auf 2B und C beziehen) für bis zu 3 Wochen. Solche Kolonien sollten sich nicht auf die beiden Kontrollschalen (mCherry-MEFs und untransduzierten MEF) sichtbar sein. </li></ol> 6. Isolierung einzelner ITSC Linien Hinweis: Für Schritt 6.3 eine Gewebekultur Haube ist nicht erforderlich. Es wird empfohlen, den inversen Mikroskop mit 70% Ethanol abzuwischen, um die Chancen auf eine bakterielle Kontamination zu minimieren. Einzel ITSC Kolonien können zwischen den Tagen 21 und 28 Tagen nach der Transdifferenzierungs isoliert werden. <ol><li> In 40 ul 0,05% Trypsin / EDTA-Lösung in 12 Vertiefungen einer 96-U-Boden-Well-Platte und die Schale auf dem Eis. </li><li> Vor Kolonieisolierung, aspirieren Medium auf 4F-MEF transdifferentiation Gericht. Waschen Sie die Zellen einmal mit 10 ml PBS. Wieder, 10 ml PBS und Ort Schale unter einem inversen Mikroskop. </li><li> Mit einer 100-ul-Pipette auf 40 ul eingestellt einzelnen Kolonien Lift, durch circling sie mit der Pipettenspitze und dem schwimmenden Kolonie Absaugen. Transfer Zellen einer Kolonie jeweils in eine Vertiefung der vorbereiteten Schale mit 96 Vertiefungen. Nach dem Pflücken 12 Kolonien platzieren Schale mit 96 Vertiefungen in den Inkubator bei 37 ° C für 5 min. </li><li> Distanzieren Zellen durch Auf- und Abpipettieren mehrmals und Transfer Zellsuspension in eine Vertiefung einer Schale mit 24 Vertiefungen mit vorbereiteten 500 ul TS-CM-Medium (30% Frisch TS-Medium + 70% CM + FGF4 / Heparin). </li><li> Am folgenden Tag ersetzen Medium mit frischem TS-CM-Medium toten Zellen zu entfernen. Ändern Medium jeden zweiten Tag. </li><li> Monitor für Auftreten von epithelialen Kolonien mit hellen Grenzen (siehe Abbildung 2). Sobald Kolonien erscheinen, Kultur bis 70% konfluent oder für bis zu einer Woche und nach und nach größere Gerichte erweitern auf. Von nun an Kulturzellen als bona fide TSCs, nach Standardprotokollen in serumhaltigen Medien oder in serumfreiem, definiertem Medium 3,5,11. </li></ol>

<ol><li>Cambuli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+memory+of+the+first+cell+fate+decision+prevents+complete+ES+cell+reprogramming+into+trophoblast%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+commun%22%5BJournal%5D)">Epigenetic memory of the first cell fate decision prevents complete ES cell reprogramming into trophoblast.</a> Nat commun. 5, 5538(2014).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Pluripotent+Stem+Cells+from+Mouse+Embryonic+and+Adult+Fibroblast+Cultures+by+Defined+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li>
<li>Kubaczka, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Induction+of+Trophoblast+Stem+Cells+from+Murine+Fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Direct Induction of Trophoblast Stem Cells from Murine Fibroblasts.</a> Cell Stem Cell. 17 (5), 557-568 (2015).</li>
<li>Benchetrit, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+Nuclear+Reprogramming+Underlies+Lineage+Conversion+into+Functional+Trophoblast+Stem-like+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Extensive Nuclear Reprogramming Underlies Lineage Conversion into Functional Trophoblast Stem-like Cells.</a> Cell Stem Cell. 17 (5), 543-556 (2015).</li>
<li>Tanaka, S., Kunath, T., Hadjantonakis, A. K., Nagy, A., Rossant, J. Promotion of trophoblast stem cell proliferation by FGF4. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTanaka%2C+S+%22Science%22">Science</a>. 282 (5396), 2072-2075 (1998).</li>
<li>Erlebacher, A., Price, K. A., Glimcher, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+mouse+trophoblast+stem+cell+proliferation+by+TGF-beta%2Factivin%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Maintenance of mouse trophoblast stem cell proliferation by TGF-beta/activin.</a> Dev Biol. 275 (1), 158-169 (2004).</li>
<li>Hochedlinger, K., Yamada, Y., Beard, C., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ectopic+expression+of+Oct-4+blocks+progenitor-cell+differentiation+and+causes+dysplasia+in+epithelial+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ectopic expression of Oct-4 blocks progenitor-cell differentiation and causes dysplasia in epithelial tissues.</a> Cell. 121 (3), 465-477 (2005).</li>
<li>Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+mouse+embryonic+fibroblast+cells+suitable+for+culturing+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> J Vis Exp. (64), (2012).</li>
<li>Maherali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-efficiency+system+for+the+generation+and+study+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A high-efficiency system for the generation and study of human induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3 (3), 340-345 (2008).</li>
<li>Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+replication-defective+retrovirus+by+transient+transfection+of+293T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293T cells.</a> J Vis Exp. (10), e550(2007).</li>
<li>Kubaczka, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+Maintenance+of+Murine+Trophoblast+Stem+Cells+under+Defined+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Derivation and Maintenance of Murine Trophoblast Stem Cells under Defined Conditions.</a> Stem Cell Rep. 2 (2), 232-242 (2014).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Das 4-Faktor (Tfap2c, Gata3, Eomes, Ets2) auf der Basis transdifferentiation Protokoll hier vorgestellten bietet eine zuverlässige Methode treu zu erzeugen umgewandelt iTSCs von embryonalen Maus-Fibroblasten. Ferner ist das Verfahren auch für die postnatale tail Fibroblasten, allerdings mit einem Rückgang der Effizienz 3 embryonale Fibroblasten im Vergleich zu. Im allgemeinen Qualität der primären Fibroblasten ist ein kritischer Faktor transdifferentiation Ergebnis und Sorgfalt sollte frühen Passage-Zellen (P...

Vor kurzem wurde eine Studie mehrere Ansätze von embryonalen Maus-Stammzellen zu vergleichen Stammzellen Umwandlung in Trophoblasten hat ergeben, dass in allen untersuchten Systemen Linie Umwandlung unvollständig geblieben. Anstelle von induzierten Trophoblasten Stammzellen (iTSCs) so Trophoblast Stammzellen-ähnliche Zellen genannt wurden generiert 1 einem Speicher des Zellschicksals Herkunftshalte. Hier verfolgen wir einen anderen Ansatz der ITSC Generation. Ähnlich wie bei der direkten Induktion von pluripotenten Stammzellen , die aus murinen embryonalen Fibroblasten (MEF) 2, haben iTSCs wurde von differenzierten somatischen Gewebe direkt umgesetzt. Zunächst identifizierten wir 12 Kandidaten Faktoren induzieren TSC Schicksal, wenn sie in MEFs überexprimiert. Später, die Faktoren Tfap2c, Gata3, Eomes und Ets2 wurden für die ITSC Induktion 3 notwendig und ausreichend zu sein , identifiziert. Gleichzeitig fand eine andere Gruppe unabhängig Tfap2c, Gata3 und Eomes ausreichend, um MEFs zu konvertieren in iTSCs. Jedoch, dassStudie, die Zeit für die Transgen - Expression erforderlich ist , deutlich länger im Vergleich zu unserer Studie verschiedene Umwandlungskinetik anzeigt, wenn Ets2 vom transdifferentiation Cocktail 4 abwesend ist. Herkömmliche fötalem Rinderserum (FBS) enthält Kultur induziert und Blastozysten abgeleitet Trophoblast Stammzellen beruht auf der Anwesenheit von Faktoren , die durch Wachstumsinaktivierten MEFs sezerniert 5,6. Während der Induktions ITSC werden diese Faktoren durch MEFs vorgesehen, die die vollständige Kombination von Transgenen fehlt und die nicht transdifferentiation laufen. Sobald jedoch einzelne ITSC Kolonien sind subkultiviert, benötigen sie Medien, die durch das Wachstum-inaktivierten MEF vorkonditioniert wurde. Von da an iTSCs können nach Standardprotokollen wie Blastozysten abgeleitet TSCs kultiviert und behandelt werden. Bemerkenswert ist , im Gegensatz zu Tanaka et al. 5, wir routinemßig Kultur TSCs und iTSCs ohne Gelatinieren Zellkulturschalen.

<table><tbody><tr><td>Doxycyclinhyclat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891-10G</td><td>In sterilem PBS auflösen, 2 mg/ml Stammlösung herstellen. Lagern Sie Aliquots bei -20 > C</td></tr><tr><td>Chloroquin-Diphosphat-Salz&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6628-25G</td><td>Bereiten Sie eine 25 mM Stammlösung in sterilem Wasser in Zellkulturqualität vor. Lagern Sie Aliquots bei -20 > C</td></tr><tr><td>Polybren (Hexadimethrinbromid)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>107689-10G</td><td>Bereiten Sie 8 mg/ml Stammlösung in sterilem Wasser in Zellkulturqualität vor. Lagern Sie Aliquots bei -20 > C</td></tr><tr><td>humaner rekombinanter Fibroblasten-Wachstumsfaktor 4</td><td>ReliaTech</td><td>300-131L</td><td>In sterilem 0,1% BSA in PBS auflösen, vorbereiten 25 &; Mikro; g/ml Stammlösung. Lagern Sie Aliquots bei -80 &de; C</td></tr><tr><td>Heparin-Natriumsalz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149-10KU</td><td>1 mg/ml Stammlösung durch Auflösen in sterilem PBS herstellen. Lagern Sie Aliquots bei -80 Grad; C</td></tr><tr><td>ProFection Mammalian Transfection System</td><td>Promega</td><td>E1200</td><td></td></tr><tr><td>PBS, ohne Calcium, ohne Magnesium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>1419-094</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (1x) + GlutaMAX</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640, ohne Glutamin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31870-025</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM (1x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12491-015</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,05%), Phenolrot</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Hyklon</td><td>SH30071.03IR</td><td></td></tr><tr><td>Tensidfreier Celluloseacetat-Membranfilter</td><td>Corning</td><td>431220</td><td></td></tr><tr><td>Nicht-essentielle</td> <td>AminosäurenThermoFisher Scientific</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvat&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11360-039</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25030-24</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO), Zellkulturqualität</td><td>Panreac AppliChem GmbH</td><td>A3672,0100</td><td></td></tr><tr><td>pLV-tetO-Tfap2c</td><td>Addgen</td><td>70269</td><td></td></tr><tr><td>pLV-tetO-Gata3</td><td>Addgen</td><td>70270</td><td></td></tr><tr><td>pLV-tetO-Eomes</td><td>Addgen</td><td>70271</td><td></td></tr><tr><td>pLV-tetO-Ets2</td><td>Addgen</td><td>70272</td><td></td></tr><tr><td>pLV-tetO-mCherry</td><td>Addgene</td><td>70273</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgen</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>FUdeltaGW-rtTA&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>19780</td><td></td></tr><tr><td>Mäuse B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm1(rtTA*M2)Jae/J 7</td><td>JAX Mäuse</td><td>6965</td><td></td></tr><tr><td>129S2SV</td><td>Charles River</td><td>129</td><td></td></tr></tbody></table>

protokoll für die direkte umwandlung von murinen embryonalen fibroblasten in trophoblast stammzellen

Protocol for the Direct Conversion of Murine Embryonic Fibroblasts into Trophoblast Stem Cells

Trophoblast Stammzellen (TSZ) entstehen als Folge der ersten Zellschicksal Entscheidung in Säugetierentwicklung. Sie können in vitro kultiviert werden, die Fähigkeit zur Selbsterneuerung zu halten und in alle Subtypen des Trophoblasten lineage, äquivalent zu der in vivo zu differenzieren , um den fetalen Teils der Plazenta - Zellpopulation stammen führt. Deshalb bieten TSCs ein einzigartiges Modell Entwicklung der Plazenta und embryonale gegen außer embryonale Zellschicksal Entscheidung in vitro zu studieren. Von der Blastozysten-Stadium ab, eine deutliche bestehend epigenetische Barriere von DNA-Methylierung und Histon-Modifikationen trennt eng beide Linien. Hier beschreiben wir ein Protokoll um alle Funktionen der Linie Barriere durch transiente Überexpression von trophoblast Schlüsselregulatoren überwinden Tfap2c, Gata3, Eomes und Ets2 in murinen embryonalen Fibroblasten. Die trophoblast induzierten Stammzellen sind in der Lage selbst zu erneuern und sind nahezu identisch abgeleitet trophoblast Stammzellen Blastozyste in Bezug auf die Morphologie, Marker Genexpression und Methylierungsmuster. Funktionelle in vitro und in vivo - Assays bestätigen , daß diese Zellen entlang der Trophoblast lineage Erzeugung polyploid Trophoblasten Riesenzellen und chimerizing die Plazenta , wenn sie in Blastozysten injiziert zu differenzieren können. Die Induktion von Trophoblast Stammzellen aus somatischen Gewebe eröffnet neue Wege genetischen und epigenetischen Merkmale dieser extraembryonale Linie zu studieren und bietet die Möglichkeit, trophoblast Stammzelllinien ohne Zerstörung des jeweiligen Embryo zu erzeugen.

Auf der Schale , wo die transgene Expression des 4F aktiviert wird, ändern sich Zellen schnell Morphologie (2A und B vergleichen). Um Tag 14-21 verschiedene transdifferentiated Bereiche entstehen (zwei Beispiele in 2B und C angegeben sind). Diese primären Kolonien fehlen typische TSC Morphologie; aber sobald sie subkultiviert, charakteristisch epitheliale Morphologie mit engen Kanten und helle Grenzen erinnert stark an bona fide TSCs entsteht (2D...

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die direkte Umwandlung von murinen embryonalen Fibroblasten in voll funktionsfähige und stabile Trophoblasten-Stammzellen durch zehntägige Überexpression von Tfap2c, Gata3, Eomes und Ets2.

Protokoll für die direkte Umwandlung von murinen embryonalen Fibroblasten in Trophoblast Stammzellen

Trophoblast stem cells (TSCs) arise as a consequence of the first cell fate decision in mammalian development. They can be cultured in vitro, retaining ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, echte induzierte Trophoblasten-Stammzellen oder iTSCs aus murinen Fibroblasten zu erzeugen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Stammzellen bezüglich der Natur der Barriere zwischen embryonaler und extraembryonaler Linie zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass die transgene Expression nur vorübergehend aktiviert wird, was die Selektion stabil umgewandelter Zellen erleichtert.In einem Biosicherheitslabor der Stufe zwei unter Verwendung der geeigneten persönlichen Schutzausrüstung werden fünf 100-Milliliter-Platten mit jeweils fünf Millilitern Poly-L-Lysin-Lösung bedeckt, wobei die Platten vorsichtig geschwenkt werden, um die Beschichtungslösung gleichmäßig zu verteilen. Die Platten werden für 30 Minuten in einen 37 °C warmen Inkubator gestellt, anschließend wird das Poly-L-Lysin abgesaugt und die Platten einmal mit PBS gespült. Danach werden je sieben mal 10 hoch 6 293T-Zellen pro Platte in 10 Milliliter 293T-Zellmedium ausgesät, die Platten leicht geschwenkt, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen, und anschließend wieder in den Inkubator zurückgebracht.Am nächsten Morgen ersetzen Sie das Wachstumsmedium durch fünf Milliliter Transfektionsmedium. Behandeln Sie die Kulturen anschließend mit sechs Mikrolitern einer 1000X-Stammlösung der Chloroquinlösung und stellen Sie die Platten wieder in den Inkubator bei 37 Grad Celsius. Um die Transfektionsmischung herzustellen, geben Sie für jeden lentiviralen Vektor 600 Mikroliter Lentivektor-DNA-Lösung tropfenweise unter Vortexen zu 600 Mikrolitern 2X HEPES-pufferter Salzlösung und inkubieren Sie die Transfektionsmischung bei Raumtemperatur.Nach 15 Minuten die Mischung äußerst vorsichtig tropfenweise zu den vorbereiteten 293-T-Zellen hinzufügen und die Schalen zurück in den Inkubator stellen. Nach fünf bis sechs Stunden das Medium durch 10 Milliliter Virusproduktionsmedium ersetzen und die Platten erneut in den Inkubator stellen. Am folgenden Morgen das Medium vorsichtig durch sieben Milliliter frisches Virusproduktionsmedium ersetzen und erneut über Nacht inkubieren.Überführen Sie anschließend das Medium von jeder Platte in einzelne konische 15-Milliliter-Röhrchen und geben Sie sieben Milliliter frisches Virusproduktionsmedium auf die Platten für eine weitere Übernacht-Inkubation. Am nächsten Morgen gewinnen Sie die zweite Charge des virushaltigen Mediums, vereinigen das Überstand mit der ersten Viruscharge und filtrieren das virushaltige Medium durch einen 0,45-Mikrometer-Filter aus tensidfreier Celluloseacetatmembran zur Lagerung in 500-Mikroliter-Aliquoten bei minus 80. Um die Fibroblasten in induzierte Trophoblasten-Stammzellen umzuwandeln, waschen Sie die transduzierten embryonalen Fibroblasten oder MEFs zweimal mit je zwei Milliliter PBS.Anschließend lösen Sie die Zellen mit 0,5 Milliliter Trypsin-EDTA-Lösung bei 37 Grad Celsius ab. Nach drei bis vier Minuten überprüfen Sie unter einem umgekehrten Mikroskop, ob sich die Zellen von der Platte gelöst haben, und stoppen Sie die Trypsinwirkung durch Zugabe von einem Milliliter TS-Medium. Überführen Sie die Zellsuspensionen in einzelne 15-Milliliter-Konizflaschen und zentrifugieren Sie die Zellen.Dann die Pellets in zwei Milliliter TS-Medium resuspendieren und jeweils 105 der vier Faktoren exprimierenden mCherry- oder Kontroll-MEFs ohne Transduktion pro 100-Milliliter-Platte in 10 Milliliter TS-Medium, das Fibroblasten-Wachstumsfaktor 4 und Heparin sowie Doxycyclin als Supplement enthält, für eine Übernachtkultur plattieren. Am nächsten Tag unter einem Epifluoreszenzmikroskop die Expression des mCherry-Proteins zur Abschätzung der Transduktionseffizienz heranziehen. Falls die Transduktionseffizienz etwa 100 % beträgt, die Kulturen in den Inkubator zurückstellen und das Medium in allen Platten im Wechsel alle zwei Tage bis zum Tag 10 erneuern.Anschließend die Zellen mit frischem TS-Medium, das Fibroblastenwachstumsfaktor vier und Heparin, jedoch kein Doxycyclin enthält, versorgen und mithilfe des invertierten Mikroskops das Auftreten von transdifferenzierten Bereichen auf der Vier-Faktoren-Platte bis zu drei Wochen lang überwachen. Die Identifizierung der transdifferenzierten Bereiche ist entscheidend, da die MEFs zu diesem Zeitpunkt morphologisch nicht den Trophoblasten-Stammzellen ähneln. Achten Sie auf dicht aufgetürmte Kolonien in der Nähe von Trophoblasten-Riesenzellen, die an ihrer Zellgröße und ihrem großen Kern zu erkennen sind.Um einzelne iTSC-Linien zu isolieren, desinfizieren Sie zunächst das umgekehrte Mikroskop mit 70 %igem Ethanol, um die Gefahr einer bakteriellen Kontamination zu minimieren. Geben Sie anschließend 40 Mikroliter 0,5 %iger Trypsin-EDTA-Lösung in 12 Vertiefungen einer 96er-U-Boden-Platte und stellen Sie die Platte auf Eis. Saugen Sie nun das Medium aus der Vier-Faktor-MEF-Umdifferenzierungsplatte ab und waschen Sie die Zellen einmal mit 10 Millilitern PBS.Nach der Wäsche 10 Milliliter frisches PBS zu den Zellen geben und die Platte auf die Umkehrmikroskopbühne stellen. Mit einer 100-Mikroliter-Pipette, die auf 40 Mikroliter eingestellt ist, jede einzelne Kolonie mit der Pipettenspitze umkreisen und die resultierende schwimmende Kolonie aspirations. Jede Kolonie in einzelne Vertiefungen der 96-Loch-Platte überführen, bis 12 Kolonien ausgewählt wurden.Anschließend inkubieren Sie die Kolonien fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Am Ende der Inkubation lösen Sie die Zellen durch Pipettieren auf und überführen die Zellsuspensionen in einzelne Vertiefungen einer 24-Loch-Platte, die jeweils 500 µL komplettes TS-Medium mit Fibroblastenwachstumsfaktor und Heparin enthalten, um sie über Nacht zu kultivieren. Am nächsten Tag ersetzen Sie das Medium durch frisches komplettes TS-Medium mit Fibroblastenwachstumsfaktor und Heparin, um abgestorbene Zellen zu entfernen, und stellen die Platte erneut in den Inkubator.Überwachen Sie die Kulturen täglich auf das Auftreten von epithelialen Kolonien mit hellen Begrenzungen. Sobald die Kolonien beobachtet werden, kultivieren Sie die Zellen bis zu einer Woche lang oder bis sie 70 % konfluent sind. In Kulturen, bei denen die Transgenexpression der vier Faktoren aktiviert ist, verändern die Zellen rasch ihre Morphologie.Um die Tage 14 bis 21 herum treten deutliche transdifferenzierte Bereiche auf. Diese primären Kolonien weisen nicht die typische Morphologie von Trophoblasten-Stammzellen auf; nach einer Subkultivierung zeigt sich jedoch eine charakteristische epitheliale Morphologie mit scharfen Rändern und hellen Begrenzungen, die stark an echte Trophoblasten-Stammzellen erinnert. Solange die durch die vier Faktoren induzierten Trophoblasten-Stammzellen positiv für den Trophoblasten-Transkriptionsfaktor Cdx2 und Tfap2c bleiben, können diese Zelllinien für nachfolgende In-vitro- oder In-vivo-Analysen verwendet werden.Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb von sechs Wochen abgeschlossen werden. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie die Blastocysten-assistierte Injektion angewendet werden, um zusätzliche Fragen bezüglich des Chimerisierungspotenzials der erzeugten iTSCs zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern auf dem Gebiet der frühen Linienabscheidung den Weg, um die Umwandlung des embryonalen versus extraembryonalen Zellschicksals bei Mäusen zu untersuchen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man neue embryonale Fibroblasten direkt in induzierte Trophoblasten-Stammzellen umwandelt. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Lentiviralvektoren äußerst gefährlich sein kann und dass stets Vorsichtsmaßnahmen wie die Anwendung von Sicherheitsstufe-2-konformen Arbeitsverfahren eingehalten werden sollten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

In diesem Video zeigen wir die Isolierung der Maus Blastozysten und die Ableitung der Trophoblast-Stammzellen aus Blastozysten. Wir beschreiben auch Bedingungen für die Wartung der Stammzell-Eigenschaft sowie die Induktion der Differenzierung in Kultur.

Ableitung der Maus Trophoblast Stammzellen aus Blastozysten

Die Qualität von embryonalen Maus-Fibroblasten (MEFs) durch die rechte Mausstamm wie CF-1 bestimmt. Pluripotenz-unterstützende MEFs und konditionierte Medien (CM) aus diesen gewonnenen Erkenntnisse sollten den optimalen Konzentrationen von Activin A, Gremlin und TGFß1 für die Activin / Nodal und FGF Signalwege erforderlich, um kooperativ zu halten Selbsterneuerung und Pluripotenz enthalten.

Vorbereitung von embryonalen Maus-Fibroblasten-Zellen zum Kultivieren von humanen embryonalen und induzierten pluripotenten Stammzellen

Wir beschreiben ein Protokoll zur Gewinnung von lentiviral basierten, reprogrammierten und charakterisierten faktorfreien humanen induzierten pluripotenten Stammzellen und zur Umwandlung in mutmaßliche klinische Bedingungen.

Ableitung und Charakterisierung eines Transgens freie Menschen induzierten pluripotenten Stammzelllinie und Umwandlung in Definierte Clinical-Grade Bedingungen

Das hier beschriebene Protokoll beschreibt die Induktion eines hämogenen Programms in embryonalen Fibroblasten der Maus durch Überexpression eines minimalen Satzes von Transkriptionsfaktoren. Diese Technologie kann auf das menschliche System übertragen werden, um Plattformen für zukünftige Studien zur Hämatopoese, zu hämatologischen Erkrankungen und hämatopoetischen Stammzelltransplantationen bereitzustellen.

Maus Umprogrammieren Embryonale Fibroblasten mit Transkriptionsfaktoren ein Hemogenic Programm zu induzieren

In dieser Studie erzeugen wir induzierte pluripotente Stammzellen aus Fruchtwasserzellen der Maus unter Verwendung eines nicht-viralen Transposon-Systems.

Die Herstellung von pluripotenten Stammzellen aus Maus Fruchtwasserzellen ein Transposon-System verwenden

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur effizienten Erzeugung menschlicher trophoblastischer Zellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen unter Verwendung des knochenmorphogenen Proteins 4 und Inhibitoren der Activin/Nodal-Signalwege. Diese Methode eignet sich für die effiziente Differenzierung von humanen pluripotenten Stammzellen und kann große Mengen an Zellen für die genetische Manipulation erzeugen.

In vitro Differenzierung von humanen pluripotenten Zellen in Trophoblastische Stammzellen

Dieses Manuskript beschreibt ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Generierung und Quantifizierung verschiedener reprogrammierter kardialer Subtypen unter Verwendung einer Retrovirus-vermittelten Verabreichung von Gata4, Hand2, Mef2c und Tbx5.

Die Beurteilung Cardiomyocyte Subtypes Nach Transcription Factor-vermittelte Reprogrammierung von embryonalen Maus-Fibroblasten

Hier stellen wir Ihnen unser Protokoll für Herstellung von induzierten erythroiden Vorläuferzellen (iEPs) von Maus Erwachsenen Fibroblasten mit Transkription Faktor-driven direkte Abstammung Neuprogrammierung (DLR).

Direkte Linie Reprogrammierung von adulten Maus-Fibroblasten zu erythroiden Vorläuferzellen

Hier beschreiben wir eine Methode zur Erwärmung verglaster menschlicher Blastozysten, die sie durch die Implantationsphase in vitro kultivieren, sie in einzelne Zellen verdauen und frühe Trophoblastenzellen für weitere Untersuchungen sammeln.

Einzelzellsammlung von Trophoblastenzellen im Peri-Implantationsstadium menschliche Embryonen

Dieses Protokoll beschreibt eine Technik zur Beurteilung von Veränderungen im mütterlichen Gefäßsystem während der Schwangerschaft bei Mäusen. Mit stereologischen Methoden wird der Umbau der dezidualen Spiralarterien quantitativ beurteilt und die Ergebnisse immunhistochemisch qualitativ bestätigt.

Beurteilung der Maternal Vascular Remodeling während der Schwangerschaft in der Gebärmutter Maus

Lernen Sie die direkte Umwandlung muriner embryonaler Fibroblasten in Trophoblast-Stammzellen durch transiente Überexpression spezifischer Transkriptionsfaktoren. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung embryonaler und extraembryonaler Differenzierungswege.

Protokoll für die direkte Umwandlung von murinen embryonalen Fibroblasten in Trophoblast Stammzellen

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