Analyse von DNA-Methylierung

DNA-Methylierung ist eine chemische Modifikation der DNA, die gen-Expression in verschiedenen zellulären Kontexten betrifft. Viele Forscher sind der Mechanismus und die Funktionen dieses Prozesses interessiert wie aberranten DNA-Methylierung mit Krankheiten wie Krebs in Verbindung gebracht wurde.

In diesem Video behandeln wir die Grundlagen der DNA-Methylierung und Methoden, um es zu erkennen. Dann untersuchen wir ein allgemeines Protokoll für eines dieser Methoden, Bisulfit-Analyse und einige Anwendungen dieser Technik.

Zunächst werfen wir einen Blick auf welche DNA-Methylierung ist und wie es erkannt werden kann.

Bei diesem biochemischen Prozess fügt eine Zelle eine chemische Markierung bekannt als einer Methylgruppe zu Cytosin-Basen in der DNA. Die meisten methylierte Cytosines auftreten neben Guanin-Basen in der gleichen DNA-Strang und diese angrenzenden Nukleotide — und das Phosphodiester-Band, das sie verbindet – gekennzeichnet als "Verbrauchsgüter". Obwohl die meisten Wirbeltiere Verbrauchsgüter methyliert sind, neigen unmethylated sind nah beieinander in CpG "Inseln" in der Nähe von den Promotoren der aktiv ausgedrückt Gene und verschiedenen anderen regulatorischen Sequenzelemente auftreten.

Wie Änderungen in der DNA-Methylierung zur Genregulation beitragen, ist immer noch ein Thema der intensiven Untersuchung. Methylierung von CpG Inseln scheint wichtig für die stabile, langfristige Gen-silencing in epigenetische Prozesse wie genomische Prägung, die die übergeordneten Herkunftsbezeichnung Konkretisierung bestimmter Gene sowie X-Chromosom Inaktivierung, die Inaktivierung eines der beiden Chromosome in jeder Zelle der weiblichen Säugetiere ist zu sehen. Unterdrückung der kritischen Gene durch anomale Methylierung von CpG Inseln nachweislich auch zu unkontrolliertem Zellwachstum, beitragen, die zu Krebs führen kann. Mechanistisch, kann die DNA-Methylierung zur Gen-silencing durch entweder verhindern Transkriptionsfaktoren von Promotoren zuordnen, oder durch die Rekrutierung von Proteine, die Histone ändern und umgestalten Chromatin in einem transcriptionally permissive Zustand beitragen.

Es gibt mehrere Methoden zum Nachweis von DNA-Methylierung Bundesstaat.

Eine Technik, die Hilfe-Assay, beinhaltet zwei Beschränkung Endonucleases HpaII und MspI, bzw. Spalten nur unmethylated oder methylierte und unmethylated, CCGG-Sequenzen genannt. Vergleicht man die Verdauung Muster durch diese beiden Enzyme produziert, kann der Status der Methylierung der DNA abgeleitet werden.

Eine andere Methode, genannt methylierte DNA Immunopräzipitation oder "MeDIP," nutzt Antikörper, die an methylierte Cytosines binden, methylierte DNA-Sequenzen zu bereichern.

Schließlich dient Bisulfit Analyse unterscheiden methylierte aus unmethylated Cytosin in der DNA, mit der Durchführung einer chemischen Reaktion, die unmethylated Cytosin zu Uracil umwandelt. Nach dieser Umstellung kann Bisulfit-behandelte DNA PCR unterworfen, sequenziert und im Vergleich zu einer Referenz-Genom. Unmethylated Cytosines sind diejenigen, die in der Referenz vorhanden sind, aber mit Thymines nach Bisulfit-Analyse und PCR ersetzt. Durch Massenspektrometrie Bisulfit-behandelte DNA zu unterwerfen, können Forscher auch "Methylierung Epigramme," die linear repräsentieren verschiedene Verbrauchsgüter im Genom und zeigen den Grad der Methylierung an jedem von ihnen erstellen. Diese Epigramme sind besonders nützlich, wenn Forscher Methylierungsmuster zwischen verschiedenen Zelltypen vergleichen wollen.

Werfen wir nun einen tiefen Einblick in das Protokoll für die Bisulfit-Analyse.

Um zu beginnen, ist Natriumhydroxid Vorbereitungen genomic DNA hinzugefügt, die dann bei 95 ° c inkubiert werden Dies die DNA denaturiert und seine Stützpunkte für nachfolgende chemische Reaktionen zugänglich macht. Natrium-Metabisulfite wird dann in die denaturierten DNA-Mischung eingeführt, und zwei chemische Reaktionsschritte erfolgt. Während der erste Schritt, Sulfonierung, einer Sulfit-Gruppe wird hinzugefügt, um eine unmethylated Cytosin Cytosin Sulfonate bilden. Dann wird während hydrolic Deamination Sulfonate Cytosin, Uracil Sulfonate erzeugen eine Aminogruppe entfernt.

Um diese ersten Stufen der chemischen Reaktion zu erleichtern, ist die DNA-Vorbereitung mit Mineralöl, überlagert die Verdunstung verhindert und hilft, um die Konzentration von Natrium-Metabisulfite zu erhalten. Die Reaktion ist dann bei 55 ° C im Dunkeln inkubiert. Während dieses Schritts wird ein Agent zu verhindern Oxidation, wie Quinol, auch die Mischung hinzugefügt.

Die Mischung wird zentrifugiert, um veränderte DNA enthält Uracil Sulfonate und kein Mineralöl zu sammeln, und die niedrigsten Flüssigkeitsschicht wiederhergestellt. Die DNA in dieser Lösung wird dann gereinigt.

Als nächstes wird Natriumhydroxid zur DNA-Mischung hinzugefügt, die dann bei 37 ° c inkubiert wird Dies geschieht, um Desulfonation, induzieren die – wie Sie vielleicht schon erraten haben – entfernt die Sulfit-Gruppe aus Uracil Sulfonate, bildet Uracil und Abschluss der chemischen Reaktion.

Zu guter Letzt die Mischung wird mit dem Zusatz von Ammoniumacetat neutralisiert, und die DNA wird durch Ethanol Fällung gesammelt. Sobald die Bisulfit umgewandelt DNA gereinigt wurde, unterliegt es PCR und Sequenzierung.

Nun, da wir die grundlegende Technik für Bisulfit Analyse besprochen haben, schauen Sie bitte einige experimentelle Anwendungen.

Einige Forscher verwenden Bisulfit-Analyse, um genomische Prägung zu untersuchen. Hier Forscher kreuzten zwei Stämme von Arabidopsis mit genetischen Unterschieden, also das mütterliche und väterliche DNA unterschieden werden könnte. Methylierungsmuster in die entstehenden Embryonen und damit verbundenen Endosperm oder das Gewebe, das den Embryo unterstützt wurden dann verglichen. Mit dieser Methode, fanden Wissenschaftler, dass Verbrauchsgüter in der mütterlichen Allel eines Protein-Codierung Gens, MEA, tendenziell in Embryonen aber im Endosperm, unmethylated methyliert werden gewebespezifisch Prägung angibt.

Andere Forscher nutzen diese Technik zu verstehen, wie ökologische oder soziale Faktoren kann Methylierungsmuster verändern. Hier Maus Welpen wurden getrennt von ihren Müttern zu Stress auslösen, und ihr Gehirn Gewebe anschließend isoliert wurden. Anschluss an Sequenzierung von Bisulfit-behandelte DNA Wissenschaftler festgestellt, dass Methylierungsmuster in einem Hormon-Kodierung gen, AVP, in einer bestimmten Hirnregion in "getrennt" Welpen verändert was auf einen möglichen molekularen Mechanismus für langfristigen biologischen Wirkungen von frühen Lebenserfahrung.

Schließlich sind viele Forscher daran, Bisulfit-Analyse, um die Vergleichbarkeit der Methylierungsmuster zwischen individuellen, einzigartigen Zellen zu optimieren. Hier modifiziert Forscher die Bisulfit-Analyse-Methode so, dass alle Schritte ausgeführt wurden, auf einzelne Maus Eizellen eingebettet in Agarose, die zur DNA-Verlust vorzubeugen. Mit dieser Methode konnten die Forscher einzelne Eizelle Proben leicht zu identifizieren, die mit anderen Zellen durch auf der Suche nach diejenigen, die mehrere Methylierungsmuster gab kontaminiert worden waren.

Sie haben nur Jupiters Video auf Methylierung sensibel Analysen beobachtet. Hier, wir haben diskutiert, die Rolle der DNA-Methylierung in Genregulation, Methoden, mit denen Forscher methylierte Regionen im Genom, ein allgemeines Protokoll für Bisulfit-Analyse und schließlich einige Anwendungen dieser Technik zu ermitteln. Wie immer vielen Dank für das ansehen!