Name: Probenvorbereitung für Masse Spektrometrie-basierte Identifikation der RNA-bindende Regionen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: Lernen Sie die Identifizierung von RNA-bindenden Proteinen in lebenden Zellen mittels UV-vermittelter Photocrosslinking und Massenspektrometrie. Diese Methode ermöglicht die Kartierung von RNA-Bindungsregionen ohne aufwendige Aufreinigung.

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R.b. wurde von Searle Scholars Program, w. Smith Foundation (C1404) und der Marsch des Dimes Foundation (1-FY-15-344) unterstützt. Bag nimmt zur Kenntnis, Unterstützung von NIH R01GM110174 und NIH R01AI118891, Zuschüsse sowie DOD BC123187P1 zu gewähren. R.W.-T. von NIH Ausbildung Grant T32GM008216 unterstützt wurde.

1. Kultur und den Ausbau der mESCs Hinweis: embryonale Stammzellen der Maus sind leicht zu Kultur und für die große Zahl erforderlich durch biochemische Experimente dank ihrer schnellen Fahrzeit schnell erweitert werden kann. Gesunde mESCs verdoppeln jeden 12 h.
<ol><li>Expand-mESCs auf die gewünschte Anzahl auf gelierenden Platten in mESC Medium (siehe unten) in einer Gewebekultur Inkubator bei 37 ° C, 5 % CO 2, gehalten und &#62; 95 % Luftfeuchte. 
	Hinweis: Genug Platten sollte bereit sein, für 3-5 biologischen Wiederholungen für die + 4SU Probe und Kontrolle - 4SU. Eine 10-cm-Platte (d.h. 5 Millionen Zellen) ist mehr als ausreichend für jede biologische replizieren.</li>
	<li>Das Medium für mESCs setzt sich zusammen aus Dulbecco &#39; s geändert Eagle &#39; s Medium (DMEM) ergänzt mit 15 % fetalen bovine Serum (FBS), 2 mM L-Glutamin, 0,5 x Penicillin/Streptomycin, 1 X nicht-essentiellen Aminosäuren, 100 µM Beta-Mercaptoethanol, 1.000 U /mL Leukämie hemmenden Faktor (LIF), 3 µM CHIR99021, 1 µM PD0325901.</li>
	<li>Vor mESCs Passagierung, bereiten die gewünschte Anzahl von Platten 10 cm.
	<ol><li>Fügen Sie 4 mL 0,1 % Gelatine in Wasser dafür sorgen, dass die gesamte Oberfläche der Platte bedeckt ist; 10 min bei Raumtemperatur (RT) inkubieren; entfernen Gelatinelösung.</li>
	</ol></li> <li>Passage Zellen, wenn sie 10 Millionen Zellen pro Platte, in der Regel ~ 48 h nach Impfung erreicht. 
	Hinweis: Wenn mESCs in dichten Kolonien wachsen, Platten nie darf 100 % Konfluenz zu erreichen, wie für Zell-Linien beobachtet, die in Monolayer (z.B. HEK293 oder 3 t 3 Zellen) wachsen. Eine mESC Platte sollte passagiert werden, wenn ca. 50 % konfluierende und auf jeden Fall vor dem Medium gelb wird.
	<ol><li>Zellen, trennen waschen Platten mit dichten mESC Kulturen einmal in 1 x Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit 2 mM EDTA, ergänzt dann hinzufügen 0,05 % Trypsin in DMEM aufgelöst und Platte in Inkubator für 5 min zurück (37 ° C, 5 % CO 2, und &#62; 95 % (feuchte).</li>
		<li>Platte aus Inkubator und Zellen in gleicher Lautstärke von DMEM durch Pipettieren nach oben und unten kräftig mehrmals Aufschwemmen.</li>
		<li>Zählen Zellen unter Verwendung von Hemocytometer und sorgen dafür, dass Zellen eine einzellige Suspension bilden (d. h. keine Cluster), anschließend Zentrifugieren Zelle Mischung 500 X g für 5 min bei Raumtemperatur. Entfernen Sie überstand und Aufschwemmen Zelle Pellet in 1-2 mL DMEM.</li>
		<li>Zellen bei einer Dichte von 10.000 Zellen/cm 2 mESC Medium (d.h. ~ 800.000 Zellen pro 10 cm Platte) zu impfen mit der Gelatine-beschichteten Platten in Schritt 1.3.1 vorbereitet.</li>
	</ol></li></ol> 2. Crosslink Protein &#8211; RNA-Interaktionen in Zellen Leben Hinweis: RNS-Protein-Vernetzung ist vermittelt durch die Foto-aktivierbare Ribonucleoside analoge 4-Thiouridine (4SU). 4SU hat eine längere Absorption Maximum als endogene Nukleotide werden und kann nur in RNA; Mittelstufe-Wellenlänge UVB ist deshalb zu selektiv Crosslink RNA, Proteine 25 , 26 einsetzbar. UVB-Behandlung von 4SU-behandelten Zellen führt zu kovalenten Querverbindungen zwischen 4SU enthaltende RNA und Aminosäuren, mit einer gemeldeten Vorliebe für Tyr, Trp, Met, Lys und Cys 27.
<ol><li>Expand-mESCs auf die gewünschte Anzahl der 10-cm-Platten wie beschrieben in Schritt 1. 
	Hinweis: Genug Platten sollte bereit sein, für 3-5 biologischen Wiederholungen für die + 4SU Probe und Kontrolle - 4SU. Eine 10-cm-Platte (d.h. 5 Millionen Zellen) ist ausreichend für jede biologische replizieren.</li>
	<li>Bevor die Platten Konfluenz erreichen, fügen Sie 4SU direkt in Medium, eine Endkonzentration von 500 µM. verlassen - 4SU Kontrolle Geschirr unbehandelt.</li>
	<li>Shake Platten sanft um die 4SU homogen in das Medium zu verteilen. Zurück in den gleichen Gewebekultur-Inkubator für 2 h (37 ° C, 5 % CO 2, und &#62; 95 % Luftfeuchtigkeit).</li>
	<li>Platten auf einem Eiskübel übertragen und verwerfen Medium.</li>
	<li>Spülen die Platte vorsichtig mit 5 mL eiskaltem PBS. 
	Hinweis: Spülen Sie sanft oder Zellen trennen könnte.</li>
	<li>Fügen Sie 2 mL eiskaltem PBS und Ort Platten ohne Deckel in einem Vernetzer mit UVB-emittierenden Leuchtmitteln ausgestattet (312 nm). Bestrahlen Platten bei einer Energie von 1 J/cm 2. 
	Hinweis: Es ist wichtig, dass Kunststoff-Deckel entfernt werden oder sie schützen die Zellen vor UV-Licht und Vernetzung zu verhindern.</li>
	<li>Zellen unter Verwendung von Zelle Heber zu sammeln und übertragen auf eiskaltem PBS in konischen Rohren. Zentrifuge bei 2.000 x g für 5 min, 4 ° c</li>
	<li>Entfernen den Überstand und Aufschwemmen Zelle Pellet in 5 mL eiskaltem PBS mit 2 mM EDTA und 0,2 mM Phenylmethylsulfonyl Fluorid (PMSF).</li>
	<li>Graf Zellen unter Verwendung einer Hemocytometer. Erwarten Sie 5-10 und 10 Millionen Zellen von 10 cm und 15 cm Platten bzw..</li>
	<li>-Zentrifuge bei 2.000 x g für 5 min, 4 ° c 
	Hinweis: Gebeizte Zellen sofort einsetzbar für Schritt 3 oder Blitz in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei-80 ° C auf unbestimmte Zeit gespeichert werden. Dies ist ein Haltepunkt Potenzial.</li>
</ol> 3. Isolierung der Kerne Hinweis: Kerne sind isolierte zytoplasmatischen Proteine zu entfernen und Abdeckung von nuklearen Proteinen zu erhöhen. Dieser Schritt kann mit anderen Formen der zellulären Fraktionierung RBPs in verschiedenen zellulären Kompartimenten studieren ersetzt werden.
<ol><li>Bereiten Sie eiskalt Puffern einen (10 mM Tris-HCl pH 7,9, 4 ° C, 1,5 mM MgCl 2, 10 mM KCl). Verwenden Sie mindestens 2,5 mL pro 10 Millionen Zellen (wie in Schritt 2,9 gezählt) für die Extraktion. 
	Hinweis: Bestände des Puffers A (z. B. eine 500 mL Flasche) können im Voraus vorbereitet und bei 4 ° C für 6 Monate gespeichert.
	<ol><li>Vor dem Einsatz 0,5 mM Dithiothreitol (DTT) und 0,2 mM PMSF auf den gewünschten Wert (2,5 mL pro 10 Millionen Zellen) der eiskalten Puffer A. hinzufügen</li>
	</ol></li> <li>Zellen mit 2 mL Puffer A pro 10 Millionen Zellen zu waschen. Mit 2.500 x g für 5 min bei 4 ° c drehen,</li>
	<li>Verwerfen überstand hinzufügen Puffer A mit 0,2 % nichtionische, nicht Denaturierung Reinigungsmittel, wie Octyl-phen--Polyethoxy-Ethanol ergänzt (siehe die Tabelle der Materialien), 500 µL pro 10 Millionen Zellen. Für 5 min bei 4 ° c drehen</li>
	<li>Zentrifuge bei 2.500 x g für 5 min.</li>
	<li>Entfernen des Überstands, das Pellet umfasst intakt Kerne frei von Zytoplasma. 
	Hinweis: Kerne können sofort verwendet für Schritt 4 oder Blitz in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei-80 ° C gelagert auf unbestimmte Zeit. Dies ist ein Haltepunkt Potenzial.</li>
</ol> 4. Lyse der Kerne Hinweis: vernetzte Kerne sind in einem mass Spectrometry-kompatible Puffer, Proteinen und Protein-RNA-komplexe freizugeben lysiert.
<ol><li>Add Lyse Puffer (9 M Harnstoff, 100 mM Tris-HCl pH 8.0, 24 ° C), 200 µL pro 10 Millionen Zellen. Um mit einem 1/8 Chromatin Scheren beschallen &#34; Sonde bei 50 % Amplitude Einstellung für 5-10 s</li>
	<li>Spin bei 12.000 x g für 5 min und sammeln 175 µL überstand das Pellet zu vermeiden. 
	Hinweis: 100 µL wird für die nächsten Schritte der RBR-ID verwendet werden und die restlichen 75 µL lysate bei-80 ° C für spätere Verwendung und/oder western-Blot Analyse gespeichert werden können.</li>
	<li>Maßnahme Proteinkonzentration via Bradford-Test oder ähnliche Technik 28. Proteinkonzentration in den verschiedenen Proben bis 1 mg/mL oder die niedrigsten Probenkonzentration mit entsprechenden Mengen von Lyse Puffer verdünnen. 
	Hinweis: Aus den Kernen der 10 Millionen mESCs erwarten 100-200 µg Protein.</li>
</ol> 5. Trypsin-Verdauung Hinweis: Proteine sind verdaut Peptide s generierenUitable für Bottom-Up-Massenspektrometrie (MS) Analyse.
<ol><li>Fügen Sie DVB-t-Lösung für nukleare lysate (5 mM letzte); für 1 h bei RT inkubieren</li>
	<li>Iodoacetamide aus frischer Vorrat (14 mM final) hinzufügen; 30 min bei RT im Dunkeln inkubieren.</li>
	<li>Verdünnt mit 5 Mal Volumen von 50 mM NH 4 HCO 3 lysate</li>
	<li>Hinzufügen Trypsin (µg Protein: Trypsin µg = 200:1); über Nacht bei 37 ° C inkubieren.</li>
</ol> 6. Entsalzung von Peptiden <ol><li>bereiten Sie ein maßgeschneidertes Bühne Tipp pro Probe.
	<ol><li>6.1.1. Legen Sie eine CD der Festphase Extraktionsgut C18 in den unteren Teil einer Pipettenspitze 200 µL.</li>
		<li>Fügen Sie 50 µL Oligo R3 umgekehrt Phase Harz auf C18-Festplatte. Platzieren Sie Bühne Spitze innen Zentrifugation Adapter und der Ort Spitze mit Adapter in einem 1,5 mL Microfuge Rohr.</li>
		<li>Hinzufügen 100 µL 100 % Acetonitril, Tipps zu waschen. Zentrifuge bei 1000 X g für 1 min um das Lösungsmittel zu entfernen.</li>
		<li>Äquilibriert mit 50 µL 0.1 % Trifluoroacetic Säure (TFA). Zentrifuge bei 1000 X g für 1 min.</li>
	</ol></li> <li>100 % Ameisensäure hinzufügen verdauten Protein Probe zu verringern Sie den pH-Wert auf ca. 2-3. 
	Hinweis: Dies sollte ~ 5 µL pro 1 mL der verdünnten Peptid Probe erfordern, aber pH-Wert gemessen und mehr Ameisensäure Säure hinzugefügt werden sollte ggf..</li>
	<li>Last Probe auf maßgeschneiderte Bühne Tipp, Zentrifuge bei 1000 X g für 1 min bis alle Probe durch die Spitze geht.</li>
	<li>Waschen gebunden Peptide mit 50 µL 0.1 % TFA. Zentrifuge bei 1000 X g für 1 min.</li>
	<li>Peptide durch Zugabe von 50 µL Elution Buffer eluieren (75 % Acetonitril, 0,025 % TFA) Bühne Tipp und Zentrifuge bei 1000 X g für 1 min der Elution Buffer aus der Spitze zwingen.</li>
	<li>Trocknen Sie die Probe mit einem Vakuum Zentrifuge gesetzt bei 150 X g und 1-3 kPa für 1 h 
	Hinweis: Getrocknete Peptide können bei-80 ° C auf unbestimmte Zeit gespeichert werden. Dies ist ein Haltepunkt Potenzial.</li>
</ol> 7. Entfernung von querverbunden RNA Hinweis: Behandlung von Peptiden mit Nuklease querverbunden RNA entfernen.
<ol><li>Aufschwemmen das Pellet in 50 µL 2 x Nuklease Puffer (100 mM NH 4 HCO 3, 4 mM MgCl 2).</li>
	<li>Maßnahme Peptid-Konzentration mit Absorption bei 280 nm vorausgesetzt, 1 mg/mL von Peptiden für eine A-280 von 1. 
	Hinweis: Die erwartete Konzentration beträgt 1 mg/mL.</li>
	<li>Passen Sie alle Proben um 1 mg/mL oder die niedrigste Konzentration mit 2 x Nuklease Puffer.</li>
	<li>Bereiten Sie einen master-Mix von 50 µL H 2 O + 1 µL hochreine Nuklease (&#8805; 250 U) (siehe die Tabelle der Materialien) pro Probe.</li>
	<li>50 µL Peptid Probe nehmen und fügen Sie 50 µL H 2 O + Nuklease master Mix.</li>
	<li>Inkubation bei 37 ° C für 1 h zur Massenspektrometrie durchführen gehen. 
	Hinweis: Die Peptide sind nun bereit für die Massenspektrometrie. Sie können sofort analysiert oder auf unbestimmte Zeit bei-80 ° C gelagert werden. Dies ist ein Haltepunkt Potenzial.</li>
</ol> 8. Nano Flüssigchromatographie, Mass Spectrometry und Rohdatenverarbeitung Hinweis: da 4SU-Vernetzung die Masse des Peptids ändert, deren Ionen zählen nicht in Richtung der Intensität des Peptids unvernetzten während LC-MS/MS, Daher scheint die durch die Vernetzung verringert werden. Der Grad und die Konsistenz von diesem Rückgang spiegelt den Grad der Protein-RNA-Vernetzung für jedes Peptid 24.
<ol><li>Bereiten HPLC puffert wie folgt: 0,1 % Ameisensäure in HPLC-Grade Wasser (Puffer A); 0,1 % Ameisensäure in Acetonitril HPLC-Grade (Puffer B).</li>
	<li>Wenn ein Nano-HPLC vorhanden ist, schließen Sie eine Nano-Spalte mit den folgenden Spezifikationen: Innendurchmesser 75 µm; mit C18-AQ Partikel; verpackt Länge 20-25 cm. 
	Hinweis: Wenn der HPLC erhältlich bei höheren Strömungsgeschwindigkeiten ausgeführt wird, verwenden Sie eine ordnungsgemäße Spaltengröße für die angegebenen Volumenstrom. Höherer Durchfluss Chromatographie verringert Empfindlichkeit.</li>
	<li>Programm der HPLC-Methode wie folgt: Flow Rate 250-300 nL/min, Steigung von 2 bis 28 % Puffer B in 120 min, 28 bis 80 % B für die nächsten 5 min und isokratischen 80 % B für 10 min. 
	Hinweis: Wenn der HPLC keine automatisierte Spalte Gleichgewichtherstellung vorherige Probenbeladung haben, starten Sie das Programm mit 10 min bei 0 % B vor dem Einlegen der Probenmaterials.</li>
	<li>Programm der MS Erwerbsmethode datenabhängiges Erwerb (DDA) als standard Schrotflinte Proteomics Experimente durchführen. Das Tastverhältnis Instrument sollte vollständige MS-Scans mit Tandem MS Scans (oder MS/MS) der intensivsten Signale wechseln. Verwenden Sie die optimalen Einstellungen für Proteomics MS läuft. 
	Hinweis: Für zuversichtlich Ergebnisse Scannen verwenden Instrumente, die mindestens die vollständige MS durchführen können im Modus "hohe Auflösung" (z.B. Orbitrap, Time-of-Flight). Für genaue Quantifizierung, stellen sicher, dass die Intervalle zwischen den vollständige MS-Scans sind nicht mehr als 3 S. längere Arbeitszyklen genaue Definition der extrahierten Ion Chromatogramme verhindern könnte.</li>
	<li>Laden 1-2 µg der Probe auf der HPLC-Säule und die HPLC-MS/MS-Methode ausführen, wie programmiert. Für jede biologische replizieren führen Sie mindestens zwei unabhängigen Läufe und behandeln sie als technische Wiederholungen.</li>
	<li>Nach MS, importieren Sie die raw-Dateien in ein Proteomik-Software-Paket für MS/MS Spektren Identifizierung und Quantifizierung der Peptid über extrahierten Ionenchromatographie. Wir empfehlen Software-Pakete, die chromatographische Ausrichtung mehrerer ausführen kann MS ausgeführt wird (siehe die Tabelle der Materialien) 29 , 30.</li>
	<li>Wenn die Option in der Softwaresuite verfügbar ist, aktivieren Sie &#34; Match zwischen läuft &#34; vor Beginn der Datenverarbeitung.</li>
	<li>Sobald die Analyse abgeschlossen ist, exportieren Sie die Peptid-Liste zusammen mit den Werten der Quantifizierung.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Wir beschreiben ein detaillierte experimentelle Protokoll ausführen RBR-ID in mESCs und mit entsprechenden Modifikationen in eine beliebige Zelle, die 4SU in RNA integrieren können. Andere Zelltypen erfordern Optimierung des Konzepts für ein ausreichendes Signal Rauschabstand zu gewährleisten. Darüber hinaus während des Protokolls hierin konzentriert sich auf die Prüfung der nuklearen RBPs beschrieben, sollte die RBR-ID-Technologie leicht verschiedenen zellulären Kompartimenten wie dem Zytosol oder spezifische Organellen...

Der RBR-ID-Methode soll neuen RNA-bindende Proteine (RBPs) zu identifizieren und ordnen Sie ihre RNA-bindende Regionen (RBRs) mit Peptid-Ebene Auflösung ermöglichen die Gestaltung von RNA-bindende Mutanten und die Untersuchung der biologischen und biochemischen Funktionen von Protein-RNA-Interaktionen.
RNA ist einzigartig unter den Biomolekülen, denn es kann sowohl fungieren als ein Bote die genetischen Informationen und auch in komplexe dreidimensionale Strukturen mit biochemischen Funktionen eher derjenigen Proteine1,2Falten. Eine wachsende Zahl von Beweisen zufolge forensisches RNAs (NcRNAs) spielen eine wichtige Rolle in verschiedenen gen Regulierungs- und epigenetische Wege3,4,5 , und in der Regel werden diese regulatorischen Funktionen im Konzert vermittelt mit Proteinen, die speziell mit einem bestimmten RNA interagieren. Von besonderer Bedeutung wurde eine Reihe von interagierenden Proteine für die intensiv studierte lange NcRNA (LncRNA) Xist, wertvolle Einblicke in wie diese LncRNA X-Chromosom Inaktivierung in weiblichen Zellen6,7 vermittelt kürzlich identifiziert. ,8. Bemerkenswert ist, könnte mehrere dieser Xist-Interaktion Proteine enthalten keine kanonischen RNA-bindende Domänen9, und daher ihre RNA-bindende Aktivität nicht vorhergesagt in Silico basierend auf ihre primäre Sequenz allein. Wenn man bedenkt, dass Tausende von LncRNAs in einer bestimmten Zelle10ausgedrückt werden, ist es vernünftig anzunehmen, dass viele von ihnen über Interaktionen mit handeln könnte, doch sein RNA-bindende Proteine (RBPs) entdeckt. Eine experimentelle Strategie, um diese neuartige RBPs identifizieren würde daher die Aufgabe die biologische Funktion von NcRNAs sezieren erheblich erleichtern.
Frühere Versuche, RBPs empirisch ermitteln Vertrauen auf PolyA + RNA Auswahl gekoppelt mit Massenspektrometrie (MS)11,12,13,14,15. Obwohl diese Experimente viele Proteine in die Liste der vermeintlichen RBPs hinzugefügt, könnte sie standardmäßig nur Proteine gebunden, Polyadenylated Abschriften erkennen. Die meisten kleinen RNAs und viele LncRNAs sind jedoch nicht Polyadenylated. 16 , 17 und ihre interagierenden Proteine hätte wahrscheinlich in diesen Experimenten verpasst worden. Eine aktuelle Studie angewendet Computerlernen Proteinprotein Interaktom-Datenbanken, um Proteine zu identifizieren, die gemeinsam mit mehreren bekannten RBPs gereinigt und zeigte, dass diese wiederkehrende RBP-Partner eher RNA-bindende Aktivitäten18zu besitzen. Doch dieser Ansatz stützt sich auf Bergbau große Interaktion Datenbanken und erkennen nur Proteine, die Co gereinigten nicht denaturierenden Bedingungen mit bekannten RBPs, also ohne aus der Analyse unlöslich, Membran eingebettet und knapp sein kann Proteine.
Die Identifizierung eines Proteins als Bona Fide RBP oft nicht automatisch Informationen zur biologischen und/oder biochemische Funktion der Protein-RNA-Interaktion Ausbeute. Um diesen Punkt zu begegnen, ist es in der Regel wünschenswert, die Domäne und Aminosäure Proteinreste an der Interaktion Beteiligten zu identifizieren, so dass bestimmte Mutanten gestaltet werden können, testen Sie die Funktion des RNA-bindende im Zusammenhang mit jeder Roman RBP19, 20. frühere Bemühungen von unserer Fraktion und anderen haben zum rekombinantes Proteinfragmente und Löschung Mutanten RNA bindenden Regionen (RBRs)19,20,21,22; identifizieren solche Ansätze sind jedoch arbeitsintensiv und unvereinbar mit Hochdurchsatz-Analysen. Vor kurzem beschrieben eine Studie eine experimentelle Strategie zur RNA-bindende Aktivitäten in einer Hochdurchsatz-Mode mit Massenspektrometrie23Karte; jedoch dieser Ansatz stützte sich auf eine doppelte PolyA + RNA-Auswahl, und so trug die gleichen Einschränkungen wie die RBP Identifikation Ansätze beschrieben.
Wir entwickelten eine Technik, genannt RNA bindenden Region Identifikation (RBR-ID), die Protein-RNA-Photocrosslinking und quantitative Massenspektrometrie, Proteine und Eiweiß Regionen mit RNA in lebenden Zellen ohne Interaktion identifizieren nutzt Annahme auf der RNA Polyadenylation Status, also auch RBPs verpflichtet PolyA-RNAs24. Darüber hinaus diese Methode stützt sich ausschließlich auf Vernetzung und hat keine Anforderungen an Protein Löslichkeit oder Zugänglichkeit und eignet sich somit zur RNA-bindende Aktivitäten innerhalb von Membranen (z.B. die Kernhülle) oder schwerlösliche Fächer (Karte z.B. die Kernmatrix). Wir beschreiben die experimentellen Schritte ausführen RBR-ID für die Kerne der embryonalen Stammzellen der Maus (mESCs) sollte mit geringfügigen Änderungen dieses Protokolls jedoch geeignet für eine Vielzahl von Zelltypen, vorausgesetzt, dass sie effizient 4SU aus der Kultur integrieren können Medium.

<table><tbody><tr><td>KnockOut DMEM Fisher</td><td>Scientific</td><td>10829018</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum, qualifiziert, US-Herkunft</td><td>Fisher Scientific</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin-Lösung 200 mM</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin-Lösung</td><td>Sigma</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>MEM Nicht-essentielle Aminosäurelösung (100&mal;)</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>ESGRO Leukämie-Hemmfaktor (LIF)</td><td>EMD Millipore ESG1106</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Tocris</td><td>4423</td><td></td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Sigma</td><td>PZ0162</td><td></td></tr><tr><td>Gelatinelösung, 2% in Wasser</td><td>Sigma</td><td>G1393</td><td></td></tr><tr><td>4-Thiouriidin</td><td>Sigma</td><td>T4509</td><td>50 mM Lagerbestand in Wasser</td></tr><tr><td>Spektrolinker XL-1500</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-992-90</td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethansulfonylfluorid</td><td>Sigma</td><td>78830</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL CO-630</td><td>Sigma</td><td>542334</td><td>Kommerzielle Form von Octyl-Phenoxy-Polyethoxy-Ethanol-Waschmittel</td></tr><tr><td>Jodacetamid</td><td>Sigma</td><td>I6125</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin, </td><td>Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>Empore Festphasen-Extraktionsscheibe</td><td>3M</td><td>66883</td><td></td></tr><tr><td>OLIGO R3 Reversed - Phase Resin</td><td>Fisher Scientific</td><td>1133903</td><td></td></tr><tr><td>Benzonase</td><td>Sigma</td><td>E8263</td><td>Hochreine Nuklease</td></tr><tr><td>Sonic Dismembrator Modell 100</td><td>Fisher Scientific</td><td>eingestellt</td><td>aktualisiert mit FB505110</td></tr><tr><td>Acetonitril in HPLC-Qualität</td><td>Fisher Chemical</td><td>A955-4</td><td></td></tr><tr><td>Wasser in HPLC-Qualität</td><td>Fisher Scientific</td><td>W6 4</td><td></td></tr><tr><td>TFA</td><td>Fisher Scientific</td><td>A11650</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumbicarbonat</td><td>Sigma</td><td>A6141</td><td></td></tr><tr><td>Essigsäure</td><td>Sigma</td><td>49199</td><td></td></tr><tr><td>Ameisensäure</td><td>Sigma</td><td>F0507</td><td></td></tr><tr><td>ReproSil-Pur 18-AQ</td><td>Dr. Maisch GmbH HPLC</td><td>r13.aq.0003</td><td>Packungsmaterial für HPLC-Säule</td></tr><tr><td>Kapillare für Nanosäulen (75 & Mikro; m)</td><td>Molex</td><td>1068150017</td><td></td></tr><tr><td>MaxQuant-Software</td><td>Max-Planck-Institut für Biochemie</td><td></td><td>Kann chromatographisches Alignment mehrerer MS-Läufe durchführen</td></tr></tbody></table>

probenvorbereitung für masse spektrometrie-basierte identifikation der rna-bindende regionen

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Forensisches RNAs spielen eine wichtige Rolle in mehreren nukleare Prozesse, einschließlich der Regulierung der Genexpression, Chromatinstruktur und DNA-Reparatur. In den meisten Fällen ist die Wirkung von nichtcodierender RNA durch Proteine vermittelt, deren Funktionen durch diese Interaktionen mit nichtcodierender RNA wiederum reguliert werden. Einklang mit diesem, eine wachsende Zahl von Proteinen, die in atomaren Funktionen berichtet wurde RNA binden und in einigen Fällen die RNA-bindende Regionen dieser Proteine haben kartiert, oft durch mühsame, Kandidaten-basierte Methoden.
Hier berichten wir über ein detailliertes Protokoll, eine Hochdurchsatz-, Proteom-weite unvoreingenommene Identifizierung der RNA-bindende Proteine und RNA-bindende Regionen durchzuführen. Die Methode stützt sich auf die Aufnahme von einem photoreaktiven Uridin analog in die zelluläre RNA, gefolgt von UV-vermittelten Protein-RNA-Vernetzung und Massenspektrometrie analysiert RNA-vernetzt-Peptide in das Proteom zu offenbaren. Obwohl wir die embryonalen Stammzellen der Maus beschrieben, sollte das Protokoll eine Vielzahl von kultivierten Zellen leicht angepasst.

Abbildung 1 zeigt die RBR-ID-Workflow. Aufgrund der relativ geringen Vernetzungseffizienz dieser Technik ist es sehr wichtig, die Erschöpfung Ebene und die Konsistenz des beobachteten Effekts (P -Wert) biologischer Replikate zu beachten. Abbildung 2 zeigt ein Vulkan-Grundstück von RBR-ID Ergebnis. Peptide, die RNA Anerkennung Motiv (RRM) Domäne überlappt zeigen sehr konsistent Erschöpfung. RRM Domänen können als Positivk...

Wir beschreiben ein Protokoll zur RNA-bindende Proteine und RNA-bindende Regionen in lebenden Zellen mit UV-vermittelten Photocrosslinking und Massenspektrometrie.

Probenvorbereitung für Masse Spektrometrie-basierte Identifikation der RNA-bindende Regionen

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, RNA-bindende Proteine in lebenden Zellen zu identifizieren und ihre RNA-Bindungsregionen mittels UV-vermittelter Photo-Crosslinking-Technik gefolgt von Massenspektrometrie zu kartieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Epigenetik zu beantworten, beispielsweise welche epigenetischen Regulatoren an RNA gebunden sind und welche Proteinbereiche für die Wechselwirkungen erforderlich sind. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass keine Reinigung der Protein-RNA-Komplexe erforderlich ist, wodurch nur geringe Materialmengen benötigt werden und Proteine erfasst werden können, die an jede Art von RNA gebunden sind.Wie dargestellt, konzentriert sich diese Methode auf nukleäre Proteine, da dies unser wissenschaftliches Interesse ist, könnte jedoch mit geringfügigen Modifikationen der Fraktionierungsschritte auch zur Untersuchung von RNA und bindenden Proteinen in anderen zellulären Kompartimenten verwendet werden. Nachdem die Maus-ES-Zellen gemäß dem Textprotokoll kultiviert und expandiert wurden, vermehren Sie die Zellen auf die erforderliche Anzahl von 10-Zentimeter-Platten. Bevor die Platten konfluent werden, geben Sie vier SU direkt in das Medium ein, um eine Endkonzentration von 500 Mikromolar zu erreichen.Lassen Sie die 4sU-Kontrollplatten unbehandelt. Schütteln Sie die Platten vorsichtig, um das 4sU gleichmäßig im Medium zu verteilen, und stellen Sie sie dann für zwei Stunden in denselben Zellkultur-Inkubator zurück. Die Effizienz der 4sU-Inkorporierung variiert je nach Zelltyp, weshalb es möglicherweise notwendig ist, die Konzentration und die Inkubationszeit zu optimieren, um eine effiziente Vernetzung sicherzustellen und Toxizität zu minimieren.Als Nächstes überführen Sie die Platten in einen Eisbehälter und entsorgen das Medium. Anschließend spülen Sie die Platten vorsichtig mit 5 Milliliter eiskaltem PBS. Geben Sie 2 Milliliter eiskaltes PBS hinzu und stellen Sie die Platten ohne Deckel in einen Vernetzer, der mit UV-B-emittierenden Lampen ausgestattet ist.Bestrahlen Sie die Platten mit einer Energie von 1 Joule pro Quadratzentimeter. Eine effiziente UV-Vernetzung ist entscheidend. Wir empfehlen die Verwendung von UV-B-Licht, jedoch kann auch UV-A verwendet werden.In jedem Fall sollte die verwendete Menge an UV-Energie optimiert werden und kann mittels PAR-CLIP oder ChIRP überwacht werden. Verwenden Sie Zellabheber, um die Zellen zu sammeln, und überführen Sie sie in kalte PBS-Lösung in kegelförmigen Röhrchen. Anschließend zentrifugieren Sie die Zellen bei 2000 × g und vier Grad Celsius für fünf Minuten.Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in fünf Milliliter eiskaltem PBS mit 2 Millimolar EDTA und 0,2 Millimolar PMSF. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer. Erwarten Sie fünf bis zehn Millionen und zehn bis zwanzig Millionen Zellen von 10-Zentimeter- und 15-Zentimeter-Platten respectively.Anschließend die Zellen bei 2000 × g und 4 °C fünf Minuten lang zentrifugieren. Um Kerne aus den Zellen zu isolieren, kaltes Puffer A gemäß dem im Text beschriebenen Protokoll herstellen. Vor der Verwendung 0,5 mmolaren DTT und 0,2 mmolaren PMSF zur gewünschten Menge an Puffer A hinzufügen. 2 mL des kalten Puffers zur Zellprobe hinzufügen, um diese zu waschen, danach die Zellen bei 2500 × g und 4 °C fünf Minuten lang zentrifugieren.Entfernen Sie den Überstand und geben Sie Puffer A, der mit 0,2 Prozent eines nichtionischen, nicht-denaturierenden Detergens ergänzt wurde, hinzu. Anschließend rotieren Sie die Probe bei 4 Grad Celsius für fünf Minuten. Nach dem Zentrifugieren der Zellen bei 2500 × g für fünf Minuten entfernen Sie den Überstand. Das Pellet besteht aus intakten Kernen, die frei von Zytoplasma sind.Um die Kerne zu lysieren, 200 Mikroliter Lysispuffer dem Röhrchen hinzufügen. Die Probe mit einer 1/8-Zoll-Sonde bei einer Amplitude von 50 Prozent für fünf bis zehn Sekunden beschallen, um die Chromatin-DNA zu fragmentieren. Die Probe bei 12.000 × g für fünf Minuten zentrifugieren und nur 175 Mikroliter Überstand abnehmen, um das Pellet zu vermeiden.Als Nächstes die Proteinkonzentration mittels Bradford-Assay oder einer ähnlichen Methode bestimmen. Anschließend das Protein in den verschiedenen Proben mit Lysepuffer auf 1 Milligramm pro Milliliter oder die niedrigste Probenkonzentration verdünnen. Eine 5-Millimolar-DTT-Lösung zum nukleären Lysat hinzufügen und die Probe eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren.Danach 14 Millimolar Iodacetamid aus frischer Stammlösung zugeben und das Lysat 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren. Das Lysat mit dem fünffachen Volumen 50 Millimolar Ammoniumbicarbonat verdünnen und dann Trypsin hinzufügen. Die Probe über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubieren.Um einen maßgeschneiderten Stage-Tipp pro Probe herzustellen, geben Sie eine Scheibe aus Festphasen-Extraktionsmaterial der Typ C18 in den Boden einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze. Geben Sie 50 Mikroliter Oligo-R3-Rückstandsphase-Harz auf die C18-Scheibe, setzen Sie den Stage-Tipp in einen Zentrifugieradapter und stellen Sie den Adapter in ein 1,5-Milliliter-Mikrofugengefäß. Geben Sie 100 Mikroliter 100-prozentiges Acetonitril zu den Spitzen, um diese zu waschen.Anschließend die Tips bei 1000 × g für eine Minute zentrifugieren, um das Lösungsmittel zu entfernen. Die Tips mit 50 µL 0,1-prozentiger Trifluoressigsäure oder TFA äquilibrieren. Danach erneut zentrifugieren.Formi­saure in einer Konzentration von 100 Prozent zu der verdauten Prote­inprobe hinzufügen, um den pH-Wert auf 2 bis 3 zu senken. Anschließend die Probe auf eine selbst­hergestellte Stage-Tip auftragen und die Probe bei 1000 × g eine Minute lang zentrifugieren, bis die gesamte Probe die Spitze durchlaufen hat. Die gebun­denen Peptide mit 50 Mikroliter 0,1-prozentiger TFA waschen.Danach wird die Probe bei 1000 × g für eine Minute zentrifugiert, und die Peptide werden eluiert, indem 50 µL Elutionspuffer zum Stage-Tipp gegeben und erneut bei 1000 × g für eine Minute zentrifugiert werden, um den Elutionspuffer aus dem Tipp zu pressen. Die Probe wird unter Verwendung einer Vakuumzentrifuge, die auf 150 × g und 1 bis 3 kPa eingestellt ist, für eine Stunde getrocknet. Um vernetzte RNA aus der Probe zu entfernen, wird das Pellet in 50 µL 2× Nukleasepuffer resuspendiert.Messen Sie die Peptidkonzentration bei 280 Nanometern unter der Annahme von 1 Milligramm pro Milliliter Peptide für einen A280 von 1. Verwenden Sie 2x Nuklease-Puffer, um alle Proben auf 1 Milligramm pro Milliliter oder auf die niedrigste Konzentration einzustellen, und bereiten Sie anschließend einen Master-Mix aus 50 Mikroliter Wasser und 1 Mikroliter hochreiner Nuklease pro Probe vor. Kombinieren Sie 50 Mikroliter Peptidprobe mit 50 Mikroliter Wasser-Nuklease-Master-Mix.Als Nächstes die Probe eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Schließlich die Nanoflüssigkeitschromatographie, Massenspektrometrie und Datenverarbeitung gemäß dem Textprotokoll durchführen. Diese Abbildung zeigt ein Vulkandiagramm eines RBR-id-Ergebnisses aus mausischen ES-Zellen.Peptide, die mit einer RNA-Erkennungsmotiv-Domäne überlappen, sind blau dargestellt und zeigen sehr konsistente Depletionsniveaus. Ein RNA-bindendes Peptid aus HNRNPC ist rot hervorgehoben. Dargestellt ist hier eine Wärmekarte der RBR-id-Scores, die als Schätzung der RNA-Bindewahrscheinlichkeit eines Proteinbereichs berechnet werden.Die Bewertung wird auf die Oberfläche der Spleißosomen-Untereinheit U1-70k projiziert. Die intensive rote Farbe in der Nähe der RNA-Kontaktstelle, wie sie durch die Kristallstruktur bestimmt wurde, weist auf eine korrekte Identifizierung der Protein-RNA-Interaktion hin. In dieser Abbildung wird TET2 als ein neuartiges RBP präsentiert, und die RNA-Bindungsaktivität wird einer C-terminalen Region zugeordnet, indem die RBR-id-Bewertung entlang der primären Sequenz des Proteins dargestellt wird.Schließlich könnte die Notwendigkeit dieses neuartigen RBR verifiziert werden, indem PAR-CLIP mit der Wildtyp-Sequenz durchgeführt und das Signal mit dem eines Mutanten, der das vorhergesagte RBR fehlt, verglichen wird. Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie bei ordnungsgemäßer Durchführung innerhalb von sieben bis acht Stunden an zwei Tagen durchgeführt werden. Vor der Vernetzung können Zellen mit verschiedenen Behandlungen stimuliert werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise wie die Differenzierung beginnt oder wie der Zellzyklus RNA-Protein-Interaktionen reguliert.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Extras erzeugt, die vernetzte Protein-RNA-Komplexe enthalten, um mithilfe der Massenspektrometrie Bindungsstellen von Protein-RNA-Wechselwirkungen zu identifizieren.

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In diesem Video beschreiben wir die systematische Evolution von Liganden mit der Exponentialanreicherungsmethode (SELEX), um spezifische RNA-Bindungssequenzen für ein Zielprotein von Interesse zu identifizieren. Das Protein wird mit einem großen Pool randomisierter RNA-Sequenzen inkubiert, und die proteinbindenden RNA-Sequenzen werden isoliert, PCR-amplifiziert und sequenziert, um ihre Proteinbindungsstellen zu identifizieren.

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Sequenzspezifität ist entscheidend für die Genregulation. Regulatorische Proteine, die bestimmte Sequenzen erkennen, sind wichtig für die Genregulation. Die Definition funktioneller Bindungsstellen für solche Proteine ist ein schwieriges biologisches Problem. Ein iterativer Ansatz zur Identifizierung einer Bindungsstelle für ein RNA-bindendes Protein wird hier beschrieben und ist auf alle RNA-bindenden Proteine anwendbar.

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Wir präsentieren ein detailliertes reparaturbasiertes Analyseprotokoll für kleine RNA-Bibliotheken mit weniger Voreingenommenheit als Standardmethoden und einer erhöhten Empfindlichkeit für 2'-O-Methyl-RNAs. Dieses Protokoll kann mit hausgemachten Reagenzien befolgt werden, um Kosten zu sparen oder Kits für die Bequemlichkeit zu verwenden.

Verbesserung der kleinen RNA-Seq: Weniger Voreingenommenheit und bessere Detektion von 2'-O-Methyl RNAs

Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für eine LC-MS-basierte Sequenzierungsmethode, die als direkte Methode zur Sequenzierung kurzer RNA (&lt;35 nt pro Lauf) ohne cDNA-Zwischenprodukt und als allgemeine Methode zur Sequenzierung verschiedener Nukleotidmodifikationen in einer einzigen Studie mit Einzelbasenpräzision verwendet werden kann.

2D-HELS MS Seq: Eine allgemeine LC-MS-basierte Methode zur direkten und de novo Sequenzierung von RNA-Gemischen mit unterschiedlichen Nukleotidmodifikationen

Die MAPS-Technologie wurde entwickelt, um das Targetom einer bestimmten regulatorischen RNA in vivo zu untersuchen. Die sRNA von Interesse ist mit einem MS2-Aptamer gekennzeichnet, das die Co-Reinigung ihrer RNA-Partner und deren Identifizierung durch RNA-Sequenzierung ermöglicht. Dieses modifizierte Protokoll eignet sich besonders für grampositive Bakterien.

MS2-Affinitätsreinigung gekoppelt mit RNA-Sequenzierung in grampositiven Bakterien

Das Protokoll enthält Anweisungen zur Modifizierung von RNA mit Dimethylsulfat für Mutationsprofilierungsexperimente. Es umfasst in vitro und in vivo Sondierung mit zwei alternativen Bibliothekspräparationsmethoden.

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Probenvorbereitung für Masse Spektrometrie-basierte Identifikation der RNA-bindende Regionen

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