Name: Experimenteller und Datenanalyse-Workflow für die Nanoindentation weicher Materie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 4 s
Description: Lernen Sie die Nanoindentation weicher Materialien wie Hydrogelen und Zellen mit einem kommerziellen Nanoindenter und Open-Source-Python-Software. Diese Methode liefert AFM-ähnliche Daten bei reduzierter Komplexität.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

GC und MAGO erkennen alle Mitglieder des CeMi an. MSS würdigt die Unterstützung durch einen EPSRC-Programmzuschuss (EP/P001114/1).
GC: Software (Beitrag zur Softwareentwicklung und Algorithmen), formale Analyse (Analyse von Nanoindentationsdaten), Validierung, Untersuchung (Nanoindentationsexperimente an Polyacrylamidgelen), Datenkuration, Schreiben (Originalentwurf, Review und Bearbeitung), Visualisierung (Abbildungen und Grafiken). MAGO: Untersuchung (Vorbereitung von Gel- und Zellproben, Nanoindentationsexperimente an Zellen), Schreiben (Originalentwurf, Review und Editierung), Visualisierung (Abbildungen und Grafiken). NA: Validierung, Schreiben (Review und Editierung). IL: Software (Beitrag zur Softwareentwicklung und Algorithmen), Validierung, Schreiben (Review und Editing); MV: Konzeptualisierung, Software (Design und Entwicklung von Originalsoftware und Algorithmen), Validierung, Ressourcen, Schreiben (Originalentwurf, Review und Redaktion), Supervision, Projektadministration, Mittelakquise MSS: Ressourcen, Schreiben (Review und Editing), Supervision, Projektadministration, Mittelakquise. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Dieses Protokoll zeigt, wie Kraftspektroskopie-Nanoindentationsdaten mit einem kommerziell erhältlichen Ferrule-Top-Nanoindenter sowohl auf Hydrogelen als auch auf einzelnen Zellen robust erfasst werden können. Darüber hinaus werden Anleitungen zur Verwendung einer in Python programmierten Open-Source-Software bereitgestellt, die einen präzisen Workflow für die Analyse von Nanoindentationsdaten umfasst.
Kritische Schritte im Protokoll Die folgenden Schritte haben sich bei d...

Die grundlegende Rolle der Mechanik in der Biologie ist heute etabliert 1,2. Von ganzen Geweben bis hin zu einzelnen Zellen können mechanische Eigenschaften über den pathophysiologischen Zustand des untersuchten Biomaterials 3,4 informieren. Zum Beispiel ist Brustgewebe, das von Krebs betroffen ist, steifer als gesundes Gewebe, ein Konzept, das die Grundlage des beliebten Palpationstests5 ist. Insbesondere wurde kürzlich gezeigt, dass die Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19), die durch das schwere akute respiratorische Syndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) verursacht wird, durch Veränderungen der mechanischen Eigenschaften von Blutzellen unterstrichen wird, einschließlich einer verminderten Verformbarkeit der Erythrozyten und einer verminderten Lymphozyten- und Neutrophilensteifigkeit im Vergleich zu Blutzellen von SARS-CoV-2-naiven Personen6.
Im Allgemeinen ist die Mechanik von Zellen und Geweben inhärent miteinander verflochten: Jedes Gewebe hat spezifische mechanische Eigenschaften, die gleichzeitig die Eigenschaften der konstituierenden Zellen und der extrazellulären Matrix (ECM) beeinflussen und von ihnen abhängen5. Aus diesem Grund beinhalten Strategien zur Untersuchung der Mechanik in der Biologie oft technische Substrate mit physiologisch relevanten mechanischen Reizen, um das Zellverhalten als Reaktion auf diese Reize aufzuklären. Zum Beispiel zeigten die bahnbrechenden Arbeiten von Engler und Kollegen, dass die Verpflichtung der mesenchymalen Stammzelllinie durch die Matrixelastizität gesteuert wird, wie an weichen und steifen zweidimensionalen Polyacrylamid (PAAm) -Hydrogelen untersucht7.
Es gibt viele Strategien zur mechanischen Charakterisierung des untersuchten Biomaterials, die in der räumlichen Skala (d.h. lokal bis zur Masse) und in der Art der Verformung (z. B. axial vs. Scherung) variieren und folglich unterschiedliche Informationen liefern, die einer sorgfältigen Interpretation bedürfen 3,8,9,10. Die Mechanik weicher Biomaterialien wird üblicherweise in Form von Steifigkeit ausgedrückt. Die Steifigkeit hängt jedoch sowohl von den Materialeigenschaften als auch von der Geometrie ab, während elastische Module grundlegende Eigenschaften eines Materials sind und unabhängig von der Geometrie des Materialssind 11. Daher beziehen sich verschiedene Elastizitätsmodule auf die Steifigkeit einer bestimmten Probe, und jeder Elastizitätsmodul umfasst den Widerstand des Materials gegen eine bestimmte Verformungsart (z. B. axial vs. Scherung) unter verschiedenen Randbedingungen (z. B. freie Expansion vs. Einschluss)11,12. Nanoindentationsexperimente ermöglichen die Quantifizierung mechanischer Eigenschaften durch das E, das mit einer einachsigen Verformung (Indentation) verbunden ist, wenn das Biomaterial nicht seitlich begrenzt ist10,11,12.
Die beliebteste Methode zur Quantifizierung von E von biologischen Systemen auf der Mikroskala ist AFM13,14,15,16. AFM ist ein extrem leistungsfähiges Werkzeug mit Kraftauflösung bis auf pN-Ebene und räumlicher Auflösung bis in die Sub-nm-Skala. Darüber hinaus bietet AFM extreme Flexibilität in Bezug auf die Kopplung mit komplementären optischen und mechanischen Werkzeugen und erweitert seine Fähigkeiten, eine Fülle von Informationen aus dem untersuchten Biomaterial zu extrahieren13. Diese attraktiven Merkmale sind jedoch mit einer Eintrittsbarriere verbunden, die durch die Komplexität des Versuchsaufbaus dargestellt wird. AFM erfordert umfangreiche Schulungen, bevor Benutzer robuste Daten erfassen können, und seine Verwendung für die tägliche mechanische Charakterisierung biologischer Materialien ist oft ungerechtfertigt, insbesondere wenn seine einzigartige Kraft und räumliche Auflösung nicht erforderlich sind.
Aus diesem Grund hat eine neue Klasse von Nanoindentern in letzter Zeit aufgrund ihrer Benutzerfreundlichkeit an Popularität gewonnen, während sie immer noch AFM-vergleichbare Daten mit Sub-nN-Kraftauflösung und μm räumlicher Auflösung bieten, die Kräfte widerspiegeln, die von Zellen über relevante Längenskalen ausgeübt und wahrgenommenwerden 2. Insbesondere Ferrule-Top-Nanoindentationsgeräte, die auf der optischen Fasersensortechnologie17,18 basieren, haben bei Forschern, die auf dem Gebiet der Mechanobiologie und darüber hinaus tätig sind, an Popularität gewonnen; Und eine Fülle von Arbeiten, die über die mechanischen Eigenschaften von Biomaterialien unter Verwendung dieser Geräte berichten, einschließlich Zellen19,20, Hydrogele8,21 und Gewebe22,23 wurden veröffentlicht. Trotz der Fähigkeit dieser Systeme, lokale dynamisch-mechanische Eigenschaften (d.h. Speicher- und Verlustmodul) zu untersuchen, bleiben quasistatische Experimente mit E die beliebteste Wahl 8,19,20,21. Kurz gesagt, quasistatische Nanoindentationsexperimente bestehen darin, die Probe mit einer konstanten Geschwindigkeit bis zu einem Sollwert einzudrücken, der entweder durch eine maximale Verschiebung, Kraft oder Eindringtiefe definiert ist, und sowohl die Kraft als auch die vertikale Position des Cantilever in sogenannten Kraft-Weg-Kurven (F-z) aufzuzeichnen. F-z-Kurven werden dann durch die Identifizierung des Kontaktpunkts (CP) in Krafteindringkurven (F-δ) umgewandelt und mit einem geeigneten Kontaktmechanikmodell (normalerweise dem Hertz-Modell13) ausgestattet, um E zu berechnen.
Während der Betrieb von Ferrule-Top-Nanoindentern AFM-Messungen ähnelt, gibt es Besonderheiten, die es wert sind, berücksichtigt zu werden. In dieser Arbeit wird eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zur robusten Erfassung von F-z-Kurven aus Zellen und gewebenachahmenden Hydrogelen unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Ferrule-Top-Nanoindenters bereitgestellt, um die Standardisierung experimenteller Verfahren zwischen Forschungsgruppen zu fördern, die dieses und andere ähnliche Geräte verwenden. Darüber hinaus werden Ratschläge gegeben, wie Hydrogelproben und -zellen am besten für die Durchführung von Nanoindentationsexperimenten vorbereitet werden können, zusammen mit Tipps zur Fehlerbehebung entlang des experimentellen Weges.
Darüber hinaus hängt ein Großteil der Variabilität der Nanoindentationsergebnisse (d. H. E und seine Verteilung) von dem spezifischen Verfahren ab, das zur Analyse von Daten verwendet wird, was nicht trivial ist. Um dieses Problem zu lösen, werden Anleitungen zur Verwendung einer neu entwickelten, in Python programmierten Open-Source-Software bereitgestellt, die mit einer benutzerfreundlichen grafischen Benutzeroberfläche (GUI) für die Batch-Analyse von F-z-Kurven ausgestattet ist. Die Software ermöglicht ein schnelles Datenscreening, das Filtern von Daten, die Berechnung des CP durch verschiedene numerische Verfahren, die konventionelle Berechnung von E sowie eine erweiterte Analyse namens Elastizitätsspektren24, die es ermöglicht, den Elastizitätsmodul der Zelle, den Elastizitätsmodul des Aktincortex und die Dicke des Aktinkortex zu schätzen. Die Software kann kostenlos von GitHub heruntergeladen werden und kann leicht angepasst werden, um Daten aus anderen Systemen zu analysieren, indem ein geeigneter Datenparser hinzugefügt wird. Es wird betont, dass dieses Protokoll für andere Ferrule-Top-Nanoindentationsvorrichtungen und andere Nanoindentationsgeräte im Allgemeinen verwendet werden kann, vorausgesetzt, einige Schritte werden gemäß den Richtlinien des spezifischen Instruments angepasst. Das Protokoll ist in Abbildung 1 schematisch zusammengefasst.

<table><tbody><tr><td>12 mm Deckgläser</td><td>VWR</td><td>631-1577P</td><td></td></tr><tr><td>35 mm zellbehandelte Kulturschalen</td><td>Greiner CELLSTAR</td><td>627160</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4058</td><td></td></tr><tr><td>Acrylsilan</td><td>Alfa Aesar</td><td>L16400</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Persulfate</td><td>Merk</td><td>7727-54-0</td><td></td></tr><tr><td>Bisacrylamid</td><td>Merk</td><td>110-26-9</td><td></td></tr><tr><td>Chiaro Nanoindenter</td><td>Optics 11 Lebensdauer</td><td></td><td>&nbsp; keine Katologennummer</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td></td><td></td><td>allgemein</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Gibco</td><td>16140071</td><td></td></tr><tr><td>High Glucose DMEM</td><td>Gibco</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td></td><td></td><td>allgemein</td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Kimberly Clark</td><td>21905-026</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger Mikroskop</td><td>Objektträger VWR</td><td>631-1550P</td><td></td></tr><tr><td>MilliQ System</td><td>Merk Millipore</td><td>ZR0Q008WW</td><td></td></tr><tr><td>OP1550 Interferometer</td><td>Optik11 Lebensdauer</td><td></td><td>keine Katalognummer</td></tr><tr><td>Optik 11 Lebenssonde (k = 0,02-0,005 N/m, R = 3-3,5 μm)</td><td>Optik 11 Lebensdauer</td><td></td><td>keine Katologenzahl</td></tr><tr><td>Optik 11 Lebenssonde (k = 0,46-0,5 N/m, R = 50-55 μm)</td><td>Optik 11 Lebensdauer</td><td></td><td>ohne Katologenzahl</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>RainX regenabweisend</td><td>RainX</td><td>26012</td><td></td></tr><tr><td>Standard Petrischalen (90 mm)</td><td>Thermo Scientific</td><td>101RTIRR</td><td></td></tr><tr><td>Tetramethylethylendiamin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>110-18-9</td><td></td></tr><tr><td>Vakuum-Exsikkator</td><td>Thermo Scientific</td><td>531-0250</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Datenerfassungssoftware (v 3.4.1)</td><td>Optics 11 Life</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GitHub Desktop (optional)</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Python 3</td><td>Python Software Foundation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Visual Studio Code (optional)</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

experimenteller und datenanalyse-workflow für die nanoindentation weicher materie

Experimental and Data Analysis Workflow for Soft Matter Nanoindentation

Nanoindentation bezieht sich auf eine Klasse von experimentellen Techniken, bei denen eine mikrometrische Kraftsonde verwendet wird, um die lokalen mechanischen Eigenschaften von weichen Biomaterialien und Zellen zu quantifizieren. Dieser Ansatz hat eine zentrale Rolle in den Bereichen Mechanobiologie, Biomaterialdesign und Tissue Engineering eingenommen, um eine korrekte mechanische Charakterisierung weicher Materialien mit einer Auflösung zu erhalten, die mit der Größe einzelner Zellen (μm) vergleichbar ist. Die beliebteste Strategie, um solche experimentellen Daten zu gewinnen, ist die Verwendung eines Rasterkraftmikroskops (AFM); Während dieses Instrument eine beispiellose Auflösung in Kraft (bis hin zu pN) und Raum (Sub-nm) bietet, ist seine Verwendbarkeit oft durch seine Komplexität eingeschränkt, die Routinemessungen von integralen Indikatoren mechanischer Eigenschaften wie dem Elastizitätsmodul (E) verhindert. Eine neue Generation von Nanoindentern, wie sie auf der optischen Fasersensortechnologie basieren, hat in letzter Zeit an Popularität gewonnen, da sie sich leicht integrieren lässt und gleichzeitig sub-nN-Kräfte mit μm-Ortsauflösung aufbringen kann, wodurch sie zur Untersuchung lokaler mechanischer Eigenschaften von Hydrogelen und Zellen geeignet sind.
In diesem Protokoll wird eine Schritt-für-Schritt-Anleitung vorgestellt, die das experimentelle Verfahren zur Erfassung von Nanoindentationsdaten auf Hydrogelen und Zellen unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Ferrule-Top-Nanofaser-Sensor-Nanoindenters beschreibt. Während einige Schritte spezifisch für das hier verwendete Instrument sind, kann das vorgeschlagene Protokoll als Leitfaden für andere Nanoindentationsvorrichtungen verwendet werden, vorausgesetzt, einige Schritte werden gemäß den Richtlinien des Herstellers angepasst. Darüber hinaus wird eine neue Open-Source-Python-Software vorgestellt, die mit einer benutzerfreundlichen grafischen Benutzeroberfläche für die Analyse von Nanoindentationsdaten ausgestattet ist, die das Screening von falsch erfassten Kurven, die Datenfilterung, die Berechnung des Kontaktpunkts durch verschiedene numerische Verfahren, die konventionelle Berechnung von E sowie eine erweiterte Analyse ermöglicht, die sich besonders für einzellige Nanoindentationsdaten eignet.

Nach dem Protokoll wird ein Satz von F-z-Kurven erhalten. Das Dataset enthält höchstwahrscheinlich gute Kurven und Kurven, die verworfen werden müssen, bevor mit der Analyse fortgefahren wird. Im Allgemeinen sollten Kurven verworfen werden, wenn sich ihre Form von der in Abbildung 4A gezeigten unterscheidet. Abbildung 5AI zeigt einen Datensatz von ~100 Kurven, die auf einem weichen PAAm-Hydrogel von erwartetem E 0,8 KPa35</sup...

Das Protokoll stellt einen vollständigen Workflow für Experimente zur Nanoindentation weicher Materialien dar, einschließlich Hydrogele und Zellen. Zunächst werden die experimentellen Schritte zur Erfassung von Kraftspektroskopiedaten detailliert beschrieben. Dann wird die Analyse solcher Daten durch eine neu entwickelte Open-Source-Python-Software detailliert, die kostenlos von GitHub heruntergeladen werden kann.

Experimenteller und Datenanalyse-Workflow für die Nanoindentation weicher Materie

Nanoindentation refers to a class of experimental techniques where a micrometric force probe is used to quantify the local mechanical properties of soft ...

Dieses Protokoll zeigt eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Messung der Steifigkeit von Hydrogelen und Zellen mit einem handelsüblichen Nanoindenter und stellt auch eine Open-Source-Software zur reproduzierbaren Analyse der erfassten Daten vor. Das Protokoll ermöglicht es uns, Rasterkraftmikroskopie-ähnliche Daten zu erhalten, jedoch zu einem Bruchteil der Komplexität. Dieses Protokoll wird also für Wissenschaftler nützlich sein, die an der Untersuchung der mechanischen Eigenschaften gesunder und kranker Proben interessiert sind, aber wir glauben auch, dass es im Zusammenhang mit der Nanoindentation für weiche Materialien von breiterer Anwendbarkeit sein wird.Nachdem Sie das Gerät eingeschaltet und die ausgewählte Sonde für das Experiment montiert haben, beginnen Sie mit der Kalibrierung der Sonde. Klicken Sie im Hauptfenster der Software auf Initialisieren. Geben Sie im angezeigten Menü Calibration (Kalibrierung) die Sondendetails in die Eingabefelder ein.Als nächstes füllen Sie eine dicke Glas-Petrischale mit einem flachen Boden mit dem gleichen Medium wie die Probenschale und passen Sie die Temperatur des Mediums an die der Probe an. Stellen Sie dann die Kalibrierschale unter die Sonde. Für die Kalibrierung in Flüssigkeit befeuchten Sie die Sonde mit einem Tropfen 70% Ethanol oder Isopropanol mit dem Ende der Pipette in leichtem Kontakt mit der Glasferrule, so dass der Tropfen über die freitragende und kugelförmige Spitze gleitet.Dann schieben Sie den Arm des Nanoindringers manuell nach unten, bis die Sonde vollständig untergetaucht ist, aber immer noch weit vom Boden der Petrischale entfernt ist. Warten Sie fünf Minuten, damit Gleichgewichtsbedingungen in der Flüssigkeit erreicht werden können. Klicken Sie anschließend im Initialisierungsmenü der Software auf Scan-Wellenlänge.Auf dem Bildschirm des Interferometers wird ein Fortschrittsbalken angezeigt. Überprüfen Sie, ob der optische Scan erfolgreich war, indem Sie zum Bereich Wellenlängen-Scan in der Interferometerbox navigieren. Klicken Sie dann im Menü Initialisieren auf Oberfläche suchen, um den Test schrittweise zu verringern.Die Sonde hört auf, sich zu bewegen, wenn sie die Glas-Petrischale berührt. Sobald die Sonde mit der Oberfläche in Kontakt ist, bewegen Sie die Sonde um einen Mikrometer nach unten, indem Sie die Pfeiltaste y nach unten im Hauptfenster der Software verwenden. Beobachten Sie das grüne Signal im Live-Fenster für Änderungen der Basislinie mit jedem Mikrometerschritt.Klicken Sie dann im Menü Initialisieren auf Kalibrieren. Wenn die Kalibrierung abgeschlossen ist, überprüfen Sie die alten und neuen Kalibrierungsfaktoren im angezeigten Popup-Fenster. Wenn der neue Kalibrierfaktor im richtigen Bereich liegt, wie im Manuskript erklärt, klicken Sie auf Neuen Faktor verwenden.Als nächstes bewegen Sie den Piezo um 500 Mikrometer nach oben. Überprüfen Sie dann, ob der Demodulationskreis korrekt kalibriert wurde, indem Sie auf dem Interferometer-Desktop zur Registerkarte Demodulation navigieren. Tippen Sie vorsichtig auf den optischen Tisch oder den Nanoindenter, um genügend Rauschen zu erzeugen.Ein weißer Kreis diskreter Datenpunkte sollte den roten Kreis ungefähr abdecken. Laden Sie die Petrischale mit der Probe auf den Mikroskoptisch und bewegen Sie die Sonde des Nanoindringers manuell an die gewünschte Position über der Probe. Schieben Sie die Sonde in Lösung und achten Sie darauf, dass ein bis zwei Millimeter zwischen der Sonde und der Probenoberfläche bleiben.Warten Sie fünf Minuten, bis die Sonde in Lösung ausgeglichen ist. Fokussieren Sie die Sonde mit dem Lichtmikroskop. Um den Elastizitätsmodul weicher Materialien zu messen, klicken Sie auf Experiment konfigurieren.Fügen Sie einen Schritt "Oberfläche suchen" und einen einzelnen Einzug in der Verschiebungssteuerung hinzu, um experimentelle Parameter zu bestimmen, die anschließend für den automatischen Matrix-Scan verwendet werden. Wenn der einzelne Einzug erfolgreich ist, konfigurieren Sie einen Matrix-Scan mit 50 bis 100 Punkten im Abstand von 10 bis 100 Mikrometern. Nachdem Sie sichergestellt haben, dass das Kontrollkästchen Oberfläche automatisch suchen aktiviert ist, klicken Sie auf Bühnenposition verwenden, um den Matrixscan von der aktuellen Bühnenposition aus zu starten.Richten Sie das Matrix-Scan-Profil in der Verschiebungssteuerung ein. Behalten Sie die Anzahl der Segmente auf fünf bei, und verwenden Sie das Standardverschiebungsprofil. Ändern Sie bei Bedarf das Verdrängungsprofil und die Zeit für jedes geneigte Segment.Überschreiten Sie nicht Dehnungsraten von mehr als 10 Mikrometern pro Sekunde. Speichern Sie das konfigurierte Experiment im gewünschten Experimentpfad. Klicken Sie auf Experiment ausführen und warten Sie, bis der Vorgang abgeschlossen ist.Wenn alle Daten erfasst sind, reinigen Sie die Sonde und schalten Sie das Gerät wie im Text beschrieben aus. Für das Screening von Kraft-Weg-Kurven und die Erstellung eines bereinigten Datensatzes im JSON-Format starten Sie vorbereiten. py über die Befehlszeile auf dem Laborcomputer.Wählen Sie das Optics11-Datenformat aus der Dropdown-Liste aus. Wenn die Daten nicht korrekt geladen werden, starten Sie die grafische Benutzeroberfläche neu und wählen Sie Optics11 Alt. Klicken Sie dann auf Ordner laden und wählen Sie einen Ordner aus, der die zu analysierenden Daten enthält.Bereinigen Sie den Datensatz mithilfe der Registerkarten auf der rechten Seite der grafischen Benutzeroberfläche. Klicken Sie dann auf JSON speichern und geben Sie einen geeigneten Namen für den bereinigten Datensatz ein. Senden Sie die JSON-Datei an den Computer, auf dem die NanoAnalysis-Software installiert wurde, falls sie sich vom aktuellen Computer unterscheidet.Starten Sie den nano. py-Datei über die Befehlszeile. Klicken Sie oben links in der grafischen Benutzeroberfläche auf Experiment laden und wählen Sie die JSON-Datei aus.Dadurch werden die Dateiliste und das Rohkurvendiagramm gefüllt, das den Datensatz in Form von Kraft-Weg-Kurven anzeigt. Aktivieren Sie im Feld Statistiken die Werte der drei Parameter N aktiviert, N fehlgeschlagen und N ausgeschlossen. Um eine bestimmte Kurve genauer zu visualisieren, klicken Sie auf die Kurve.Dadurch wird es grün hervorgehoben und im aktuellen Kurvendiagramm angezeigt. Sobald eine einzelne Kurve ausgewählt wurde, werden die R- und k-Parameter im Feld Statistik ausgefüllt. Sobald der Datensatz weiter bereinigt wurde, filtern Sie alle Rauschen in den Kurven mithilfe der im Feld Filterung implementierten Filter.Überprüfen Sie dann die gefilterten Kurven im aktuellen Kurvendiagramm. Die gefilterte Kurve ist schwarz, während die nicht gefilterte Version grün ist. Um den Kontaktpunkt zu finden, wählen Sie im Feld Kontaktpunkt eines aus einer Reihe von numerischen Verfahren aus, die in der Software implementiert wurden.Passen Sie die Parameter des Algorithmus an den Datensatz an, damit der Kontaktpunkt korrekt lokalisiert wird, wie im Manuskript erklärt. Um zu sehen, wo der Kontaktpunkt auf einer einzelnen Kurve gefunden wurde, wählen Sie die Kurve aus, indem Sie darauf klicken. Klicken Sie dann auf Inspect.Überprüfen Sie das Popup-Fenster, das angezeigt wird, um festzustellen, wo sich der Kontaktpunkt befindet. Klicken Sie anschließend auf Hertz-Analyse. Dadurch werden drei Diagramme generiert.Überprüfen Sie die Krafteinzugsdaten für jede Kurve im Datensatz zusammen mit der durchschnittlichen Hertz-Anpassung in Rot. Überprüfen Sie dann die durchschnittliche Krafteindruckkurve mit einem Fehlerband, das eine Standardabweichung anzeigt, zusammen mit der durchschnittlichen Hertz-Anpassung in Rot. Als nächstes überprüfen Sie das Streudiagramm des Elastizitätsmoduls, das sich aus der Anpassung des Hertz-Modells an jede einzelne Kurve ergibt.Überprüfen Sie das Feld Ergebnisse auf den berechneten Mittelwert des Elastizitätsmoduls und seine Standardabweichung, und stellen Sie sicher, dass sie für das gegebene Experiment angemessen sind. Klicken Sie dann im Feld Speichern auf Hertz. Geben Sie im Popup-Fenster den Dateinamen und das Verzeichnis ein und klicken Sie auf Speichern.Eine tsv-Datei wird erstellt. Öffnen Sie die tsv-Datei in einer weiteren Software zur statistischen Analyse und weiteren Darstellung. Für Zellnanoindentationsdaten klicken Sie auf Elastizitätsspektrenanalyse.Untersuchen Sie die beiden erstellten Diagramme, nämlich den Elastizitätsmodul als Funktion der Eindringtiefe für jede Kurve und den durchschnittlichen Elastizitätsmodul als Funktion der Eindringung durch ein Doppelschichtmodell. Sobald die Analyse abgeschlossen ist, klicken Sie auf ES im Feld Speichern. Dadurch wird eine tsv-Datei in das angegebene Verzeichnis exportiert, die in jeder anderen Software Ihrer Wahl geöffnet und geplottet werden kann.Ein erfolgreiches Experiment führt zum Annäherungssegment einer Kraft-Weg-Kurve mit einer klaren, flachen Basislinie, einem Übergangsbereich und einem geneigten Bereich. Kurven, die Änderungen dieser Form zeigen, können mit NanoPrepare einfach aus dem Datensatz entfernt werden. Mittlere Kraft-Eindruck-Kurven zusammen mit dem durchschnittlichen Hertz-Modell für ein weiches Polyacrylamid-Hydrogel und ein steifes Hydrogel sind hier dargestellt.Durch Aufzeichnen einzelner Werte des Elastizitätsmoduls wurde der erwartete durchschnittliche Elastizitätsmodul für beide Hydrogele ermittelt. Für Zell-Nanoindentationsexperimente zeigen die durchschnittliche Kraft-Eindring-Kurve und das entsprechende durchschnittliche Hertz-Modell, dass das Hertz-Modell die Entwicklung der Kraft mit zunehmender Eindringtiefe für Zell-Nanoindentationsexperimente nicht vollständig erfasst. Hier werden die durchschnittlichen Elastizitätsspektren bis zu einem Eindruck von 200 Nanometern demonstriert.Die durchschnittlichen Elastizitätsspektren beginnen bei einer Eindringtiefe von 200 Nanometern zuzunehmen, was auf den Beitrag eines Substrats zum untersuchten scheinbaren Elastizitätsmodul hinweist. Aus diesem Grund wurde 200 Nanometer als Anpassungsbereich sowohl für das Hertz- als auch für das Doppelschichtmodell gewählt. Die Anpassung des Doppelschichtmodells ermöglicht dem Extrakt mehr Informationen über den mechanischen Zustand der Zelle, einschließlich der Dicke des Zellaktinkortex, des Zellaktin-Kortexmoduls und des Zellvolumenmoduls, wie im Haupttext erläutert.Ein direkter Vergleich zwischen dem Hertz-Modell und dem Elastizitätsspektrenansatz in Bezug auf die Elastizitätsmodulverteilung zeigt überlappende Verteilungen mit vergleichbaren Mitteln, was die Machbarkeit des Elastizitätsspektrenansatzes zeigt. Die genaue Lokalisierung des Kontaktpunkts und die Konsistenz der ausgewählten Algorithmusparameter zwischen den zu vergleichenden Datensätzen ist von größter Bedeutung, um zuverlässige Vergleiche zwischen den Stichproben zu erhalten. Das Verfahren ist allgemein anwendbar, um die lokalen elastischen Eigenschaften biologischer Proben, einschließlich Sphäroide, Organoide, Gewebe und im Allgemeinen alle weichen Materie, zu quantifizieren.

experimental-data-analysis-workflow-for-soft-matter

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Wir beschreiben eine Methode zur Kartierung mechanischer Eigenschaften von Pflanzengewebe mit Hilfe eines Rasterkraftmikroskops (AFM). Wir konzentrieren uns darauf, wie mechanische Veränderungen, die während der Pflanzenentwicklung in der Pflanzenentwicklung auf der Weitfeld-Mesoskala stattfinden, aufgezeichnet werden können, um diese Veränderungen mit Wachstum und Morphogenese korrelieren zu können.

AFM-basierte Mapping der elastischen Eigenschaften der Zellwände: auf der Tissue-, Handy-und subzellulärer Beschlüsse

Dieses Papier zeigt die zum Sondieren räumlich korrelierten chemischen, strukturellen und mechanischen Eigenschaften des Mehrschicht Maßstab Atractosteus Spatel (A. Spatel) mit Nanoindentierung Methoden, Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie (FTIR), Rasterelektronenmikroskopie (SEM) und Röntgen Strahl-Computertomographie (Röntgen-CT). Die experimentellen Ergebnisse wurden verwendet, um die Konstruktionsprinzipien der Schutz biologischen Materialien zu untersuchen.

Charakterisierung von mehrschichtigen Fischschuppen (<em&gt; Atractosteus Spachtel</em&gt;) Verwendung Nanoindentierung, Röntgen-CT-, FTIR-und SEM

Wir präsentieren eine Reihe von Techniken zur Charakterisierung der viskoelastischen mechanischen Eigenschaften des Gehirns auf der Mikro-, Meso- und Makroskala.

Charakterisieren Multiskalige Mechanische Eigenschaften von Gehirngewebe mittels Rasterkraftmikroskopie, Schlag Einrückungen und Rheometrie

Dieses experimentelle Protokoll beschreibt, wie die Rasterkraftmikroskopie verwendet werden kann, um die Härte auf der echten Nanometerskala zu messen und einzelne atomare Plastizitätsereignisse zu detektieren.

Quantitative Härtemessung durch Instrumented AFM-Einzug

Wir präsentieren eine Methode zur Untersuchung früher osteoarthritischer Veränderungen auf zellulärer Ebene im Gelenkknorpel mittels Atomkraftmikroskopie (AFM).

Anwendung der Atomkraftmikroskopie zur Erkennung früher Osteoarthritis

Wir stellen einen Schritt-für-Schritt-Ansatz vor, um die häufigsten Probleme im Zusammenhang mit Mikroeindrücken in der Rasterkraftmikroskopie zu identifizieren und anzugehen. Wir veranschaulichen die aufkommenden Probleme an nativen menschlichen Gelenkknorpelexplantaten, die durch verschiedene Grade der Arthrose-bedingten Degeneration gekennzeichnet sind.

Auseinandersetzung mit praktischen Fragen der Rasterkraftmikroskopie-basierten Mikroeindringung an menschlichen Gelenkknorpelexplantaten

Die Quantifizierung der Kontaktfläche und der Kraft, die von einer Rasterkraftmikroskop-Sondenspitze (AFM) auf eine Probenoberfläche ausgeübt wird, ermöglicht die Bestimmung der mechanischen Eigenschaften im Nanobereich. Best Practices zur Implementierung von AFM-Cantilever-basierter Nanoindentation in Luft oder Flüssigkeit an weichen und harten Proben zur Messung des Elastizitätsmoduls oder anderer nanomechanischer Eigenschaften werden diskutiert.

Rasterkraftmikroskopie Cantilever-basierte Nanoindentation: Messungen mechanischer Eigenschaften auf der Nanoskala in Luft und Flüssigkeit

Diese Arbeit stellt ein dreidimensionales virtuelles Simulationsexperiment für Materialverformung und -versagen vor, das visualisierte experimentelle Prozesse liefert. Durch eine Reihe von Experimenten können sich die Benutzer mit den Geräten vertraut machen und die Bedienung in einer immersiven und interaktiven Lernumgebung erlernen.

Ein virtuelles Simulationsexperiment der Mechanik: Materialverformung und -versagen anhand der Rasterelektronenmikroskopie

Das vorgeschlagene Protokoll beinhaltet einen globalen Ansatz zur Bewertung der Knochenbildung im Rahmen der Knochenregeneration mit Hilfe multimodaler Analysen. Ziel ist es, qualitative und quantitative Informationen über die Knochenneubildung bereitzustellen und so die Strenge und Validität grundlegender und präklinischer Untersuchungen zu verbessern.

Umfassende Charakterisierung der Gewebemineralisierung in einem ex vivo Modell

Hier beschreiben wir eine einfache Methode zur Strukturierung oxidfreie Silizium und Germanium mit reaktiven organischen Monoschichten und demonstrieren Funktionalisierung der strukturierten Substraten mit kleinen Molekülen und Proteinen. Der Ansatz vollständig schützt Oberflächen durch chemische Oxidation, ermöglicht eine präzise Kontrolle über Funktion Morphologie und bietet leichten Zugang zu chemisch diskriminiert Muster.

Soft-Lithographie Funktionalisierung und Strukturierung Oxydfreie Silizium und Germanium

Lernen Sie die Nanoindentation weicher Materialien wie Hydrogelen und Zellen mit einem kommerziellen Nanoindenter und Open-Source-Python-Software. Diese Methode liefert AFM-ähnliche Daten bei reduzierter Komplexität.

Experimenteller und Datenanalyse-Workflow für die Nanoindentation weicher Materie

Weitere Videos entdecken