Name: Mikrofluidischer Ansatz zur Auflösung der gleichzeitigen und sequentiellen Zytokinsekretion einzelner polyfunktioneller Zellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-08T14:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Erfahren Sie die mikrofluidische Analyse der Zytokinsekretion einzelner Immunzellen in Echtzeit. Diese Methode ermöglicht die simultane Quantifizierung von IL-6, TNF-α und IL-1β aus peripheren Blutmononuklearzellen.

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<meta charset="utf8"></head><body>Mikrofluidischer Tröpfchenassay für die Analyse der Einzelzell-Zytokinsekretion

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Infektionen verursachen oft komplexe Wirtsreaktionen, an denen das angeborene und das adaptive Immunsystem beteiligt sind 1,2. Bei einer Infektion oder Erkennung von Infektionserregern können Wirtszellen eine Vielzahl von Chemo- und Zytokinen produzieren, bei denen es sich um kleine Proteine handelt, die als kritische Kommunikatoren bekannt sind und das Immunsystem modulieren3. Entzündungsfördernde Zytokine werden früh nach der Infektion freigesetzt, um die Immunantwort einzuleiten, gefolgt von entzündungshemmenden Zytokinen, die entscheidend sind, um Gewebeschäden und nachfolgende chronische oder autoinflammatorische Erkrankungen zu verhindern. Dieses Gleichgewicht zwischen Bedrohungseliminierung und Gewebeschutz manifestiert sich in einem breiten Repertoire an Zytokinen, die während der Infektion unterschiedliche Funktionen ausüben und eine Feinabstimmung der Reaktion ermöglichen 4,5. Innerhalb dieser Mischung können einzigartige Signaturen beobachtet werden, die vom Erreger und den von ihm induzierten Signalen, der Gewebelage und den Immunzellen, von denen sie stammen, abhängen. Die Freisetzung von Zytokinen scheint jedoch auch ein multifunktionaler biologischer Prozess zu sein, der für jede Zellpopulation einzigartig ist und sich in der Sekretionsdynamik und der individuellen Reaktion unterscheidet. Diese Heterogenität wird in der Literatur seit vielen Jahren beschrieben, z. B. bei T-Zell-Subpopulationen 6,7, wo Untersuchungen zu autoinflammatorischen Erkrankungen und schweren COVID-19-Infektionen eine große funktionelle Vielfalt an Entzündungsmarkern innerhalb und zwischen Patienten zeigten 8,9. In jüngster Zeit hat das Aufkommen der Einzelzellsequenzierung die hohe Plastizität und Wechselwirkung zwischen Subpopulationen innerhalb von Immunmikroumgebungen hervorgehoben, die zuvor nicht offensichtlich waren, was darauf hindeutet, dass Einzelzellmethoden notwendig sind, um diese Heterogenität zu erfassen10,11. Während neuartige Methoden zur Analyse des Transkriptoms entwickelt werden, bleibt die phänotypische Analyse eine Herausforderung, da sie gleichzeitige, quantitative und zeitaufgelöste Messungen der Proteinsekretion auf Einzelzellebene erfordert. Solche Messungen ermöglichen es uns, sezernierende Zellidentitäten, -dynamiken und -sekretionsmuster (langsam/schnell, früh/spät, simultan/sequentiell) für ein Repertoire oder eine Gruppe von Zytokinen zu untersuchen. Durch die quantitative und zeitliche Auflösung der Dynamik der Zytokinfreisetzung während einer Immunantwort könnten die daraus resultierenden Erkenntnisse ein Verständnis des zellulären Ensembles und der induzierten Reaktion ermöglichen.
In Standardprotokollen werden Zytokine in der Regel im Überstand von Zellsuspensionen und Serum unter Verwendung des Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) nachgewiesen, was zu Massensekretionsmengen führt. Massenmessungen ermöglichen keine Quantifizierung der von jeder Zelle produzierten Zytokinmengen, ein Problem, das besonders bei heterogenen Zellproben deutlich wird. Alternative Methoden wie die intrazelluläre Zytokinfärbung, der Enzyme-Linked Immunospot (ELISpot)-Assay oder mikrogravierte Assays (z. B. Isoplexis) weisen Zytokine nach, die von einzelnen Zellen exprimiert werden, liefern aber nur Endpunktmessungen12,13. Das bedeutet, dass die Sekretionsdynamik und Veränderungen, die im zellulären Sekretionsmuster während der Inkubationszeit auftreten können, ignoriert werden. Darüber hinaus können bei Endpunktmessungen nicht zwischen gleichzeitiger und sequentieller Zytokinsekretion unterschieden werden, so dass das wahre Ausmaß der gleichzeitigen Polyfunktionalität von Immunzellen in der Zytokinsekretion mit diesen Methoden unklar bleibt.
Eine Einzelzellauflösung kann mit Hilfe der Tröpfchenmikrofluidik erreicht werden, um Pikoliter-große physikalische Kompartimente zu erzeugen und zu verarbeiten, um Immunzellen auf ihre einzigartigen Zytokinsekretionsphänotypen auf Einzelzellebene zu untersuchen14,15. Diese Kompartimente bestehen aus Wasser-in-Öl-Emulsionen und können mit Hilfe von Mikrofluidik-Chips16,17 erzeugt werden. In der Tat haben tröpfchenbasierte mikrofluidische Assays eine extreme Vielseitigkeit bewiesen, wenn es darum geht, die Analyse verschiedener biologischer Proben und Repertoires auf Einzelzellebene und ihre Integration in vorgelagerte (Zell- und Reagenzienverarbeitung) und nachgelagerte Prozesse (Einzelzellsortierung, Proteomik oder Sequenzierung) zu ermöglichen18,19,20,21,22. Insbesondere ermöglichen Aufbauten, die eine Tröpfchenimmobilisierung ermöglichen, die Messung einer Einzelzellfunktionalität über die Zeit, was für die Analyse der Proteinsekretion wertvoll ist18. Darüber hinaus ermöglicht die Integration von gemultiplexten, quantitativen Assays zusätzliche Untersuchungen in bisher unzugänglichen Dimensionen, in Prozessen wie der Co-Sekretion und der Identifizierung polyfunktioneller Immunzellen23,24.
In diesem Protokoll beschreiben wir einen immobilisierten tröpfchenbasierten Einzelzell-Workflow, um die Sekretion von bis zu drei Zytokinen parallel aus einzelnen Zellen zu detektieren, zu quantifizieren und zeitlich zu messen17,23. Die Technologie bietet die Möglichkeit, die Zytokinreaktionen von über 20.000 Zellen parallel zu überwachen.
Der vorgestellte Arbeitsablauf besteht aus der mikrofluidischen Verkapselung einzelner Immunzellen und funktionalisierter Nanopartikel in 60 pL Wasser-in-Öl-Tröpfchen. Die Immobilisierung von &gt;100.000 Tröpfchen in einer Beobachtungskammer und die zeitaufgelöste Fluoreszenzmikroskopie ermöglichen die Messung der Dynamik der Zytokinsekretion in jedem Tröpfchen und jedem Zytokin (Abbildung 1A). Für jede einzelne Zelle innerhalb eines Tröpfchens wird die Zytokinsekretion durch einen Sandwich-Immunoassay gemessen, bei dem magnetische Nanopartikel, die mit einem spezifischen Fängerantikörper funktionalisiert sind, das sezernierte Zytokin binden, was zur anschließenden Verlagerung und Bindung von fluoreszenzmarkierten Detektionsantikörpern führt (Abbildung 1B, C). Durch Ausrichten der magnetischen Nanopartikel wird eine Beadline gebildet, an die die Fluoreszenzverlagerung in Gegenwart von Zytokinen quantifiziert werden kann. Hier wird die Fluoreszenzverlagerung definiert als die durchschnittliche Fluoreszenzintensität auf der Perlenlinie dividiert durch die durchschnittliche Fluoreszenzintensität des verbleibenden Tröpfchens. Dieser Assay kann für mehrere Zytokine gemultiplext werden, indem unterschiedlich funktionalisierte Nanopartikelchargen und entsprechende Detektionsantikörper, die in verschiedenen Fluoreszenzkanälenmarkiert sind, gemischt werden, was zu spezifischen Fluoreszenzverlagerungen in den verschiedenen Kanälen führt. Mit Hilfe eines angepassten Analyseskripts können Fluoreszenzverlagerungswerte extrahiert und die Bilder in dynamische Sekretionsprofile für jede einzelne Zelle und jedes Zytokin umgewandelt werden. Daher liefern die resultierenden Datensätze zahlreiche Messwerte, wie z.B. die quantitative Sekretionsmessung über die Zeit, die Identifizierung von co-sezernierenden Subpopulationen und die Verteilungen der Zellen nach sezernierten Mengen, Raten und Kombinationen von Zytokinen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66492/66492fig01.jpg"> Abbildung 1: Arbeitsablauf und Assay-Prinzip. (A) Überblick über den Arbeitsablauf zur Analyse von Zytokin-sezernierenden Zellen nach Stimulation. Einzellige Suspensionen und magnetische Nanopartikel werden hergestellt und in Öl/Wasser-Emulsionen (Tröpfchen) mit einem Volumen von 60 pL verkapselt. Tröpfchen werden immobilisiert und Nanopartikel in einem Magnetfeld ausgerichtet, bevor die Messung alle 30 Minuten für bis zu 4 Stunden erfolgt. Schließlich werden die Bilder analysiert und die Parameter für jedes Tröpfchen, jeden Zeitpunkt und jeden Fluoreszenzkanal extrahiert. Diese Zahl wurde von17 geändert. (B) Prinzip des Tröpfchen-Sandwich-Bioassays. Funktionalisierte Nanopartikel binden die sezernierten Zytokine, was dazu führt, dass fluoreszenzmarkierte Detektionsantikörper anschließend auf die Nanopartikel umgelagert werden. Diese Verschiebung der Fluoreszenz wird quantifiziert und durch Kalibrierungsexperimente validiert, die mit rekombinanten Zytokinen durchgeführt werden. Das Mischen verschiedener funktionalisierter Nanopartikel ermöglicht die Multiplexmessung von bis zu drei Zytokinen gleichzeitig. (C) In zellbasierten Experimenten werden Tröpfchen über die Messzeit verfolgt und sezernierende Zellen durch eine zeitliche Zunahme der Fluoreszenzverlagerung auf die Nanopartikel identifiziert. Die Schaltpläne sind nicht skalierbar. Mit BioRender.com erstellte Abbildung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66492/66492fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

<table><tbody><tr><td>008-FluorTensid</td><td>RAN Biotechnologies</td><td>008-Fluortensid-10G</td><td></td></tr><tr><td>2-Strahl-Tröpfchenhersteller mit Strömungsfokussierung, 30 & Mikro; m Düse, hydrophobe PFOS-Oberflächenbehandlung</td><td>Wunderli Chips</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 NHS Ester&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>A20006</td><td>https://www.thermofisher.com/ch/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/labeling-chemistry-protocols/fluorescent-amine-reactive-alexa-fluor-dye-labeling-of-igm-antibodies.html</td></tr><tr><td>Anti-Human-IL-1&beta; (Monoklonale Maus), AF647-gekennzeichnetes hauseigenes</td><td>PeproTech</td><td>500-M01B</td><td></td></tr><tr><td>ARcare92524 doppelseitiges Klebeband</td><td>Adhäsvies Forschung</td><td>ARcare92524</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Adembeads Streptavidin plus 300nm</td><td>Ademtech</td><td>Cat#03233</td><td></td></tr><tr><td>Biotinylierte Ziege Anti-Human IL-1&beta;</td><td>PeproTech</td><td>500-P21BGBT</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>Zellschaber</td><td>TPP</td><td>99002</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace Violet Cell Proliferation Kit</td><td>Invitrogen</td><td>C34557</td><td>Zellfärbelösung</td></tr><tr><td>Chromafil Xtra PTFE-45/25 Spritzenfilter</td><td>Macherey-Nagel</td><td>729205</td><td></td></tr><tr><td>Costar 6-Well, Clear Flat Unterseite Corning</td><td></td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>Countess Zellzählkammer Objektträger</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>D-Biotin</td><td>Fluorchem</td><td>M02926</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, kein Kalzium, kein Magnesium</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>14196-094</td><td></td></tr><tr><td>epT.I.P.S.&nbsp; Standard 2-200 &Mikro; l</td><td>Eppendorf</td><td>30000889</td><td></td></tr><tr><td>Ethylendiamintetraessigsäure Dinatriumsalzlösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3690</td><td></td></tr><tr><td>EZ-LINK-NHS-PEG4-Biotin</td><td>ThermoFisher</td><td>A39259</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/20217</td></tr><tr><td>FcR Blockierungsreagenz, human</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-059-901</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Handliches Spülmittel</td><td>Migros</td><td>5.01002E+11</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>HFE-7500 Öl 3M TM Novec</td><td>Fluorochem</td><td>B40045191</td><td></td></tr><tr><td>Idex F-120 Fingerenge einteilige Verschraubung, Standardrändelung, natürliches PEEK, 1/16" OD Schlauch, 10-32 konischer</td><td>Cole-Parmer</td><td>GZ-02014-15</td><td></td></tr><tr><td>IL-6 monoklonaler Antikörper (MQ2-13A5 - Ratte), FITC</td><td>ThermoFisher</td><td>11-7069-81</td><td></td></tr><tr><td>IL-6 monoklonaler Antikörper (MQ2-39C3), Biotin</td><td>ThermoFisher</td><td>13-7068-85</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut Serum Ersatz</td><td>ThermoFisher</td><td>10828-010</td><td></td></tr><tr><td>Loctite AA 3491 härtender UV-Kleber</td><td>Henkel AG & Co</td><td>3491</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger (76x26x1mm, klar weiß)</td><td>Menzel Gl&auml; ser</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mineralöl light</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>330779</td><td></td></tr><tr><td>NanoPort Montage Headless, 10-32 konisch, für 1/16" OD</td><td>Idex</td><td>N-333</td><td></td></tr><tr><td>Neodym Quadermagnet</td><td>K& J Magnetics</td><td>BZX082</td><td></td></tr><tr><td>Omnifix-F Spritze, 1 ml, LS</td><td>Braun</td><td>9161406V</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>15140-122;</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127, 0,2 &micro; m gefiltert (10%ige Lösung in Wasser)</td><td>ThermoFisher</td><td>P6866</td><td></td></tr><tr><td>Präzisionstücher</td><td>Kimtech Science</td><td>5511</td><td></td></tr><tr><td>PTFE-Mikroschläuche 0,30 > 0,76 mm</td><td>FisherScientific</td><td>1191-9445</td><td></td></tr><tr><td>PTFE-Mikroschläuche 0,56 & mal 1,07 mm</td><td>FisherScientific</td><td>1192-9445</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinantes humanes IL-1&beta;</td><td>Peprotech</td><td>Cat#200-01B</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinantes humanes IL-6</td><td>Peprotech</td><td>Cat#200-06</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinantes humanes Serumalbumin (HSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9731</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinantes humanes TNF-& alpha;</td><td>Peprotech</td><td>Cat#300-01A</td><td></td></tr><tr><td>Wiederverwendbarer Biopsiestanzer mit Durchmesser 0,75 mm und 6 mm</td><td>Stiefel</td><td>&nbsp; 504529 und 504532</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium, kein Phenolrot</td><td>Gibco</td><td>11835-030</td><td></td></tr><tr><td>Standard LPS, E. coli K12</td><td>InvivoGen</td><td>tlrl-eklps</td><td></td></tr><tr><td>Sterican Nadeln 23 G für Mikroschläuche mit 0,56 mm</td><td>Durchmesser FisherScientific</td><td>15351547</td><td></td></tr><tr><td>Sterican Nadeln 27 G für Mikroschläuche mit 0,30 mm Durchmesser</td><td>FisherScientific</td><td>15341557</td><td></td></tr><tr><td>TNF alpha Monoklonaler Antikörper (MAb11), PE</td><td>ThermoFisher</td><td>12-7349-81</td><td></td></tr><tr><td>TNF-alpha Monoklonaler Antikörper (MAb1), biotinylierter hauseigener</td><td>ThermoFisher</td><td>14-7348-85</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblauer Farbstoff (0,4%) zur Verwendung mit dem Countess Automated Cell Counter</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Vakuumfiltration "rapid"-Filtermax</td><td>TPP</td><td>99500</td><td></td></tr><tr><td>Geräte</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cameo 4 automatische Schneidemaschine</td><td>Silhouette</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cetoni Base 120 + 3x NEMESYS Niederdruck-Spritzenpumpen</td><td>Cetoni</td><td>NEM-B101-03 A</td><td></td></tr><tr><td>Countess II Automatisierter Zellzähler</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inverses Epi-Fluoreszenzmikroskop Ti2</td><td>Nikon</td><td>ECLIPSE Ti2-E, Ti2-E/B*1</td><td></td></tr><tr><td>OKO Laborkäfig Inkubator, dunkle Paneele</td><td>OKO Lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ORCA-Fusion Digital CMOS Kamera</td><td>Hammatsu</td><td>C14440</td><td></td></tr><tr><td>SOLA Light Engine</td><td>Lumencor</td><td>sola 80-10247</td><td></td></tr></tbody></table>

mikrofluidischer ansatz zur auflösung der gleichzeitigen und sequentiellen zytokinsekretion einzelner polyfunktioneller zellen 

Microfluidic Approach to Resolve Simultaneous and Sequential Cytokine Secretion of Individual Polyfunctional Cells

Die vorgestellte funktionale Einzelzellplattform ermöglichte die Messung mehrerer Parameter. Zunächst wird ähnlich wie bei Standardtechniken am Ende der Messung die Häufigkeit der sezernierenden Zellen dargestellt (Abbildung 4A). Nach der Stimulation mit 1 μg/ml Lipopolysaccharid (LPS) für 6 Stunden von mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMC) sezernierten 5,81% der Zellen IL-6 (n= 1270), 4,55% TNFα (n= 995) und 6,06% IL-1β (n= 1326).
Um die Zytokinsekretion zu quantifizieren, wurden Kalibrierkurven mit bekannten Konzentrationen rekombinanter Zytokine erstellt (Abbildung 4B). Diese Kalibrierkurven ermöglichen die Quantifizierung der Zytokinkonzentrationen in Tröpfchen über die Zeit. Beispielhaft erreichte die durchschnittliche IL-6-Konzentration in Tröpfchen nach 90 min für LPS-stimulierte PBMC ein Plateau, während die durchschnittliche IL-1β-Konzentration in Tröpfchen ab 90 min schneller anstieg, was die dynamische Auflösung der Plattform und die Möglichkeit zeigt, Zellsubpopulationen zu extrahieren, die spezifische Zytokine sezernieren (Abbildung 4C). Da sich die Konzentration zwischen den Messpunkten ändert, ist es möglich, dynamische Sekretionsraten pro Zytokin zu berechnen. Unter Berücksichtigung der durchschnittlichen Sekretionsrate für jedes Zytokin (Abbildung 4D) zeigten IL-6-sezernierende Zellen eine konstante Abnahme der durchschnittlichen Sekretionsrate, während TNFα- und IL-1β-sezernierende Zellen beide einen Anstieg der Sekretionsrate nach 90 min Messzeit und einen zweiten Rückgang nach 150 min zeigten.
Darüber hinaus ist es möglich, Zellen in Abhängigkeit von den sezernierten und co-sezernierten Zytokinen in Subpopulationen zu gruppieren (Abbildung 4E). Hier werden IL-6 und TNFα von 30,2 % bzw. 26,4 % der Zellen, die IL-6 bzw. TNFα sezernieren, einfach sezerniert, während einfach sezernierende IL-1β-Zellen 68,8 % aller IL-1β-sezernierenden Zellen ausmachten. Darüber hinaus können die Auswirkungen der Co-Sekretion auf die sezernierten Konzentrationen und Sekretionsraten geklärt werden (Abbildung 4F). Bei der Betrachtung von IL-6-sezernierenden Zellen wurden unterschiedliche Mengen an IL-6 sezerniert, wenn die Zellen zusätzlich TNFα oder IL-1β produzierten. In ähnlicher Weise unterschied sich die Verteilung der gemittelten Sekretionsraten über die Messung statistisch zwischen den Zellen, die neben TNFα (höhere Sekretionsraten) und IL-1β (niedrigere IL-6-Sekretionsraten) nur IL-6 oder IL-6 sezernierten.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66492/66492fig04.jpg"> Abbildung 4: Repräsentative Ergebnisse der IL-6-, TNFα- und IL-1β-sezernierenden PBMC nach 6-stündiger Stimulation mit 1 μg/ml LPS. (A) Prozentualer Anteil der PBMC, die IL-6, TNFα und IL-1β am Ende der 4-stündigen Messung sezerniert. (B) Multiplex-Zytokin-Kalibrierungskurven werden mit bekannten Konzentrationen rekombinanter Zytokine erstellt. Dies ermöglicht die Quantifizierung von Zellexperimenten, indem aus dem Verlagerungswert die Zytokinkonzentration im Tröpfchen berechnet wird. Die Punkte wurden mit einer nichtlinearen einphasigen Assoziationskurvenanpassung angepasst, r2=0,9926 (IL-6), 0,9901 (TNFα), 0,9990 (IL-1β). (C) Durchschnittliche sekretierte Konzentrationen von IL-6, TNFα und IL-1β, die durch Seernierung von PBMC über die Messzeit von 4 h freigesetzt wurden. (D) Durchschnittliche Sekretionsraten von IL-6, TNFα und IL-1β über die Messzeit von 4 Stunden. (E) Relativer Prozentsatz der mitsezernierenden Zellen, die IL-6, TNFα oder IL-1β und Kombinationen davon sezernieren. Normalisiert auf alle sekretierenden Zellen, die für jedes Zytokin nachgewiesen wurden. (F) Gemittelte IL-6-Konzentrationen über die Messzeit und Verteilungen der durchschnittlichen Sekretionsrate (log) für IL-6-sezernierende Zellen mit Co-Sekretionsauflösung (n=383 für nur IL-6, n=531 für IL-6 + TNFα, n= 213 für IL-6 + IL-1β und n=143 für IL-6+TNFα+IL-1β). Statistische Unterschiede in den Verteilungen der Sekretionsrate wurden mit zweiseitigen, ungepaarten, nichtparametrischen Kolmogorov-Smirnov-Tests mit einer Konfidenz von 95% bewertet, wobei der p-Wert dargestellt ist. ** (p &lt;0,002) und **** (p &lt;0,0001). Die volle Linie stellt den Median und die gestrichelte Linie die Quartile dar. nZellen insgesamt = 21 866. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66492/66492fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Um zusätzliche Informationen auf Einzelzellebene zu extrahieren, kann eine Sigmoidfunktion an die Konzentrations-Zeitpunkte jeder Zelle und jedes Zytokins angepasst werden (Abbildung 5). Ein beispielhafter Datensatz der Konzentration über die Zeit für eine Zelle und die entsprechende sigmoidale Anpassung ist in Abbildung 5A dargestellt. Hier liefert das Anpassungsverfahren der kleinsten Quadrate die folgenden Parameter: C, entsprechend dem oberen Plateauwert der Kurve, t50 , der die zeitliche Verschiebung der Kurve von Null quantifiziert, und die Hügelsteigung m, die die Steilheit des ansteigenden Teils der Sigmakurve mit 10 % und 90 % Konzentrationswerten beschreibt, die während der gesamten Messung erreicht wurden. Aus diesen Anpassungsparametern können einige Kurvendeskriptoren extrahiert werden, wie in Schritt 7.12 beschrieben. Dies ergibt Cmax, den höchsten Konzentrationswert der Daten, tstart, die Startzeit der Sekretion, definiert als das Erreichen von 10 % des Konzentrationswerts des oberen Plateaus, und SRlin, die Sekretionsrate während des ansteigenden Teils der Kurve.
Um Zellsubpopulationen zu klassifizieren, wurden die Kurvendeskriptoren, die aus allen Einzelzellanpassungen gewonnen wurden, in jeweils drei Kategorien eingeteilt: DieCmax-Werte wurden in niedrig, mittel und hoch gruppiert,wobei die t-Werte in frühe, mittlere und späteSR-Lin in langsame, mittlere und schnelle Sekretoren eingeteilt wurden. Um diese Klassifizierung zu veranschaulichen, werden vier exemplarische Einzelzellsekretionskurven und ihre entsprechenden Kurvendeskriptoren gezeigt (Abbildung 5A-D), wobei Kurve A die Eigenschaften eines frühen niedrigen Sekretors mittlerer Rate aufweist, Kurve B ein früher, langsamer und hoher Sekretor, Kurve C ein früher schneller Sekretor mit hohem Sekretor und Kurve D eine späte niedrige Sekretion. Es ist wichtig zu beachten, dass die Cutoffs für diese Kriterien zell-, zytokin- und assayparameterspezifisch sind und für jede Forschungsfrage angepasst werden müssen. Darüber hinaus wurde hier nur die IL-6-Sekretion von PBMC nach 1 μg/mL LPS-Stimulation für 6 h berücksichtigt, was bedeutet, dass die meisten Zellen mit 80% bzw. 79% frühe und hohe Sekretoren waren (Abbildung 5E-F). In Bezug auf die Sekretionsrate wurde eine bipolare Reaktion beobachtet, wobei 55% der IL-6-sezernierenden Zellen langsame Sekretoren und 39% schnelle Sekretoren sind (Abbildung 5G).
Um das Sekretionsverhalten weiter zu charakterisieren, wurden die Kurvendeskriptoren für jede Zelle gegeneinander aufgetragen und verschiedene Cluster extrahiert (Abbildung 5H-J). Es gibt keine klare Korrelation zwischent-Start undC-max (Abbildung 5H): Die beiden größten Populationen waren frühe niedrige Sekretoren und hohe Sekretoren unabhängig vom Sekretionsstart. Unter Berücksichtigung der Beziehung zwischent-Start und SRlin (Abbildung 5I) waren die meisten Zellen frühe langsame Sekretoren mit einer klaren Population von frühen hohen Sekretoren und wenigen langsamen/mittleren bis späten Sekretoren. Hinsichtlich der Korrelationen von SRlin und Cmax (Abbildung 5J) waren fast keine schnellen niedrigen bis mittleren Sekretoren vorhanden, mit nur einer größeren Population von schnellen niedrigen Sekretoren. Darüber hinaus gab es eine große Population von schnellen Sekretoren, die nicht von der maximal gemessenen Konzentration abhingen, und zwei Populationen von hohen Sekretoren, die entweder langsam oder schnell sezernierten. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Untersuchung des Zusammenhangs zwischen den Kurvendeskriptoren für einzelne Zellen zu einer wesentlich detaillierteren Analyse führt und möglicherweise neue biologische Erkenntnisse aus Einzelzellsekretionsmessungen extrahieren kann.
Mit der oben vorgestellten Analyse haben wir die Sekretionsdynamik von co-sekretierenden Zellen extrahiert (Abbildung 6). Zwei Beispielkurven zeigen eine unterschiedliche Dynamik der Co-Sekretion von IL-6 und TNFα aus zwei Einzelzellen mit einem gleichzeitigen Start beider Zytokine (Abbildung 6A) oder einem sequentiellen Sekretionsstart, wobei IL-6 zuerst sezerniert wird (Abbildung 6B). Zur Klassifizierung aller co-sekretierenden Zellen wurde eine Sekretionsverzögerung von 60 min definiert, wobei alle Zellen, die innerhalb dieses Bereichs mit der Sekretion beginnen, als simultane Sekretoren und alle Zellen mit längerer Verzögerung als sequentielle Sekretoren betrachtet werden. Diese Analyse ermöglichte auch die Beobachtung, welches Zytokin zuerst sezerniert wurde. Für IL-6 und TNFα wurde in 76 % der Zellen hauptsächlich eine gleichzeitige Co-Sekretion beobachtet (Abbildung 6C), während für IL-6 und IL-1β in 86 % der Zellen eine sequentielle Co-Sekretion beobachtet wurde, wobei IL-6 in den meisten Fällen das erste Zytokin war, das sezerniert wurde (Abbildung 6D).
Betrachtet man den Startzeitpunkt der Sekretion für die verschiedenen Zytokine für alle einzelnen co-sekretierenden Zellen, so konnte in den durchgeführten Experimenten keine eindeutige Korrelation zwischen den Startzeiten der Sekretion beobachtet werden. Für die Co-Sekretion von IL-6 und TNFα (Abbildung 6E) war ein größerer vertikaler Cluster um 0 min vorhanden, was den co-sezernierenden Zellen entspricht, die häufiger mit IL-6 beginnen. Für die Co-Sekretion von IL-6 und IL-1β (Abbildung 6F) begannen die meisten Zellen zu Beginn der Messung mit der Sekretion von IL-6, während IL-1β hauptsächlich später sezerniert wurde. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die hier vorgestellte Analyse die Identifizierung verschiedener Sekretor-Subpopulationen und komplexer Zytokin-Co-Sekretionsdynamiken ermöglichte.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66492/66492fig05.jpg"> Abbildung 5: Detaillierte Analyse verschiedener dynamischer Sekretionsmuster für einzelne IL-6-sezernierende Zellkurven. (A) Repräsentative Einzelzell-Zytokin-Konzentrationsdaten über die Messzeit mit der angepassten Sigmoidkurve und den extrahierten Parametern. (B-D) Drei beispielhafte Einzelzell-Zytokin-Konzentrationskurven für die verschiedenen Zytokinsekretortypen, die für die IL-6-Sekretion nach LPS-Stimulation gefunden wurden. (E-G) Prozentuale Anteile von IL-6-sezernierenden Zellen, die mit folgenden Kriterien (n=633) in die verschiedenen Sekretortypen eingeteilt werden: E. Cmax: niedrig &lt;5 nM, hoch &gt;19,5 nM, F. tStart: früh &lt;30 min, spät &gt;120 min, G. SRlin: langsam &lt;250 Moleküle/s, schnell &gt;750 Moleküle/s. (H-J) Beziehung zwischen den drei Sekretionskurvendeskriptoren Cmax, tstart und SRlin für jede einzelne Zelle (n=633). Die große Population bei Cmax=20nM resultiert aus dem Erreichen der oberen Nachweisgrenze des Assays. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66492/66492fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66492/66492fig06v2.jpg"> Abbildung 6: Extraktion von Co-Sekretionsmustern aus Einzelzell-Konzentrationskurven. (A-B) Repräsentative Konzentrationskurven für Einzelzellen, die IL-6 und TNFα (A) gleichzeitig bzw. (B) sequentiell co-sezernieren. (C-D) Prozentsatz der Zellen, die eine gleichzeitige und sequentielle Co-Sekretion von IL-6 und TNFα (n=249) bzw. IL-6 und IL-1β (n=72) aufweisen. Die sequentielle Sekretion wird durch die Verzögerung zwischen den Zytokinsekretionsstarts von mehr als 60 Minuten definiert. Farben zeigen an, welches der Zytokine zuerst mit der Sekretion begonnen hat. (E-F) Beziehung zwischen den Startzeiten der Sekretion für die verschiedenen Zytokine für jede sekretierende Zelle (nIL6-TNFα=249, nIL6-IL1β=72). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66492/66492fig06largev2.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Mikrofluidischer Ansatz zur Auflösung der gleichzeitigen und sequentiellen Zytokinsekretion einzelner polyfunktioneller Zellen 

Infections, autoimmune diseases, desired and adverse immunological responses to treatment can lead to a complex and dynamic cytokine response in vivo. ...

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Research

Forschung

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Immunology and Infection

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