Name: Eine Methode zur 2-Photonen-Imaging der Blutfluss in den Neocortex durch ein Cranial Fenster (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-02-25T14:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 31 s
Description: Erfahren Sie die Zweiphotonen-Mikroskopie zur Darstellung der Blutflussdynamik im Neocortex lebender Mäuse mittels fluoreszierender Dextran-Farbstoffe. Diese Methode ermöglicht chronische Bildgebung durch ein kraniales Fenster.

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Schwanzvene Injektionen von fluoreszierenden Farbstoffen Dextrane <ol><li> Um Bild zerebrale Gefäßsystem, müssen die Tiere intravenös mit einem fluoreszierenden Farbstoff injiziert werden. Wir verwenden Dextran-konjugierten Farbstoffe, weil die Dextran-Einheit verhindert der Farbstoff vor der Kreuzung das Gehirn Blut-Schranke und ein Auslaufen der Blutgefäße. </li><li> Mäuse sind mit Isofluran (4% für die Induktion, 1.5-2% während der Injektion). </li><li> Der Schwanz ist mit 70% Alkohol desinfiziert. </li><li> Mit einer 26-Gauge-Nadel, ist 75-100 ul einer 5% v / v Lösung von Rhodamin Dextran in Kochsalzlösung gelöst durch die Schwanzvene, auf halbem Weg entlang der Welle des Schwanzes injiziert. </li><li> Die Tiere können sofort nach der Schwanzvene Injektion abgebildet werden, bis der Farbstoff im Urin, was wiederum rosa wird, wenn mit einem Rhodamin-Farbstoffs in ca. 2 Stunden ausgeschieden wird. </li></ol> Imaging des Blutflusses mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie (Gesamtdauer 30-60 min pro Sitzung, abhängig von der Zahl der Schiffe abgebildet) <ol><li> Nach dem fluoreszierenden Farbstoff Dextran Injektion wird die Maus mit Isofluran (4% für die Induktion, 1-1,5% für die Bildgebung). </li><li> Die Maus ist fest verbunden mit dem Titan-bar an das Mikroskop Bühne, die eine thermo-regulierten Heizkissen, damit die Tier warm enthält. Einige Augensalbe angewendet wird, damit die Augen feucht. </li><li> Das Deckglas der Schädelbasis Fenster ist mit 70% igem Alkohol gereinigt. </li><li> Das Fenster ist parallel zur Bildebene positioniert und zentriert auf dem Gebiet der Blick unter die 4X Ziel. </li><li> Am besten ist es, ein Foto von der Hirnoberfläche Schiffe mit einer digitalen Kamera aufnehmen. Dieses Bild wird als Bild der Referenz in folgenden Imaging-Sitzungen, um das abgebildete Region immer wieder zu finden von Tag zu Tag verwendet werden. </li><li> Die 4X Ziel ist es, mit dem Eintauchen in Wasser 40X-Objektiv ohne Verschieben der Bühne ersetzt. Ein digitales Bild des Sichtfeldes wird wieder aufgenommen. Die Koordinaten auf der Bühne Manipulator sind auf Null gesetzt. </li><li> Wir verwenden scanimage die Bildaufnahme-Software. Dies wurde in MatLab von Tom Pologruto und Bernardo Sabatini im Labor von Karel Svoboda (Pologruto et al., 2003) geschrieben. Laser, Leistungsmesser, der Photomultiplier Röhren, Verstärker, etc.: Wir als nächstes auf alle anderen Geräte wieder </li><li> Der Bereich des Fensters geeignet, die abgebildet werden soll, kurz bei geringer Vergrößerung gescannt, um die besten Regionen zu finden. Sobald diese identifiziert sind, eine geringe Vergrößerung Stapel von der gewählten Region um Bild aufgenommen wird, und dessen XY-Koordinaten sind annotiert. </li><li> Zur Aufzeichnung des Blutflusses Dynamik in kleinen Gefäßen oder Kapillaren verwenden wir Linien-Scans entlang mindestens 40 mu m des Schiffes von Interesse. Diese einzelnen &quot;Sweeps&quot; dauerhafte 1 Sekunde erfolgen mit so wenig Laserleistung wie möglich und die Koordinaten und Winkel des Scannens werden aufgeschrieben. </li><li> Sobald die Bildgebung Sitzung vorbei ist, ist das Tier in einen warmen Raum, in dem sie aus der Narkose erholen können verschoben. </li></ol>

<ol><li>Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluctuations+and+stimulus-induced+changes+in+blood+flow+observed+in+individual+capillaries+in+layers+2+through+4+of+rat+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex.</a> Proc Nat Acad Sci. 95, 15741-15746 (1998).</li>
<li>Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ScanImage%3A+flexible+software+for+operating+laser+scanning+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Eng.+Online%22%5BJournal%5D)">ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.</a> Biomed. Eng. Online. 17, 2-13 (2003).</li>
<li>Zhang, S., Murphy, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+impact+of+cortical+microcirculation+on+synaptic+structure+and+sensory-evoked+hemodynamic+responses+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Imaging the impact of cortical microcirculation on synaptic structure and sensory-evoked hemodynamic responses in vivo.</a> 5, (2007).</li>
<li>Nishimura, N., Schaffer, C. B., Friedman, B., Lyden, P. D., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Penetrating+arterioles+are+a+bottleneck+in+the+perfusion+of+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Penetrating arterioles are a bottleneck in the perfusion of neocortex.</a> Proc Nat Acad Sci. 104, 365-370 (2007).</li>
</ol>

Kortikale Durchblutung Dynamik kann in vivo durch bildgebende fluoreszierenden Dextran Farbstoffe in die Schwanzvene von Nagetieren, die mit Zwei-Photonen-Mikroskopie injiziert untersucht werden. Dieses Video zeigte eine Methode, wie Bild Blutfluss Dynamik in Neokortex der Maus über einen mit Glas überdachten kranialen Fenster Vorbereitung.

<table><tbody><tr><td>Fluorescein-Isothiocyanat-Dextran</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD500S</td><td>mol. Gew. 500.000</td></tr><tr><td>Rhodamin B-Isothiocyanat-Dextran</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R9379</td><td>mol. Gew. ~70.000</td></tr></tbody></table>

eine methode zur 2-photonen-imaging der blutfluss in den neocortex durch ein cranial fenster

A Method for 2-Photon Imaging of Blood Flow in the Neocortex through a Cranial Window

Die Fähigkeit zur Abbildung der zerebralen Gefäße (von großen Schiffen auf Kapillaren) und Aufzeichnung des Blutflusses Dynamik im intakten Gehirn von lebenden Nagern ist eine leistungsstarke Technik. Mit In-vivo-2-Photonen-Mikroskopie durch ein Schädel-Fenster ist es möglich, Bild fluoreszierende Farbstoffe intravenös injiziert. Dies erlaubt es, Bild der kortikalen Gefäße und auch Messungen des Blutflusses erhalten. Diese Technik wurde ursprünglich von David Kleinfeld und Winfried Denk entwickelt. Die Methode kann verwendet werden, um den Blutfluss Dynamik während oder nach der zerebralen Ischämie zu studieren, in neurodegenerativen Erkrankungen, bei Hirntumoren oder in normale Physiologie des Gehirns. Zum Beispiel wurde verwendet, um zu untersuchen, wie Schlaganfall verursacht Veränderungen in den Blutfluss Richtung und Veränderungen in der roten Blutkörperchen Geschwindigkeit oder Fluss in und rund um den Infarkt. Hier zeigen wir, wie 2-Photonen-Mikroskopie zum Bild des Blutflusses Dynamik den Einsatz in der Großhirnrinde von Mäusen mit fluoreszierenden Farbstoffen in die Schwanzvene injiziert.

Kortikale Durchblutung Dynamik kann in vivo durch bildgebende fluoreszierenden Dextran Farbstoffe in die Schwanzvene von Nagetieren, die mit 2-Photonen-Mikroskopie injiziert untersucht werden. Dieses Video zeigt, wie man Bild Blutfluss Dynamik in Neokortex der Maus über einen mit Glas überdachten kranialen Fenster Vorbereitung.

Eine Methode zur 2-Photonen-Imaging der Blutfluss in den Neocortex durch ein Cranial Fenster

Die Fähigkeit, die zerebrale Vaskulatur (von großen Gefäßen bis hin zu Kapillaren) abzubilden und die Blutflussdynamik im intakten Gehirn lebender Nagetiere aufzuzeichnen, ist ...

Die Möglichkeit, die zerebrale Gefäßversorgung abzubilden und die Dynamik des Blutflusses im intakten Gehirn lebender Nagetiere zu erfassen, ist eine leistungsstarke Technik, die zur Untersuchung zerebraler Ischämie oder der normalen Gehirnphysiologie eingesetzt werden kann. Hier zeigen wir, wie man zwei Verfahren der Lichtmikroskopie verwendet, um die Dynamik des Blutflusses im Neokortex lebender Mäuse mittels fluoreszierender Farbstoffe, die in die Schwanzvene injiziert wurden, abzubilden. Diese Technik wurde ursprünglich von David Kleinfeld in Winfred Dank entwickelt.Herzlich willkommen, ich bin Ricardo Mota aus dem Labor von Carlos Porter Cayo am Fachbereich Neurologie der University of California Los Angeles. In einem vorherigen Video haben wir Ihnen die Methode zur Implantation eines Schädel-Fensters für chronische Bildgebungsexperimente in vivo gezeigt. Heute werden wir Ihnen das Verfahren zur Bildgebung der Durchblutungsdynamik in der Großhirnrinde durch ein Schädel-Fenster vorstellen.Diese Vorbereitung ist sehr nützlich, da sie die Abbildung tiefer Gehirnregionen mittels Zweiphotonen-Laser-Mikroskopie ermöglicht. Beginnen wir also. Um die zerebrale Gefäßstruktur abzubilden, müssen die Tiere intravenös mit einem fluoreszierenden Farbstoff injiziert werden.Wir verwenden Dextron-konjugierte Farbstoffe, da die Dextron-Gruppe verhindert, dass der Farbstoff die Blut-Hirn-Schranke überwindet und aus den Blutgefäßen austritt. Die Mäuse werden mit Isofluran anästhesiert, 4 % zur Induktion und 1,5 bis 2 % während der Injektion. Anschließend wird der Schwanz dreimal mit 70 %igem Alkohol desinfiziert, und 75 bis 100 Mikroliter einer 5 %igen Lösung von Rhodamin-Dextran in physiologischer Kochsalzlösung werden mittels einer 26-Gauge-Nadel in die Schwanzvene injiziert.In der Mitte des Schwanzes können die Tiere unmittelbar nach der Injektion in die Schwanzvene bis zur Ausscheidung des Farbstoffs über den Urin bildlich dargestellt werden, der sich bei Verwendung des ERO-Domine-Farbstoffs rosa färbt. Ungefähr zwei Stunden nach der Injektion des fluoreszierenden Dexter-Farbstoffs wird die Maus mit Isofluran anästhesiert – erneut mit 4 % zur Induktion und 1 bis 1,5 % während der Bildgebung. Die Maus wird mithilfe einer Titanstange fest auf der Mikroskopbühne befestigt, die eine temperaturgeregelt beheizte Unterlage enthält, um das Tier warm zu halten.Es wird etwas Augensalbe aufgetragen, um die Augen feucht zu halten. Das Deckglas des Schädel-Fensters wird mit 70 % Alkohol gereinigt. Das Fenster wird parallel zur Fokusebene ausgerichtet und im Sichtfeld zentriert.Unter dem 4x-Objektiv ist es am besten, mit einer Digitalkamera ein Foto der Gefäße an der Gehirnoberfläche aufzunehmen. Dieses Bild dient als Referenzbild in nachfolgenden Bildgebungssitzungen, um den Bildbereich von Tag zu Tag wiederholt zu finden. Anschließend wird das 4x-Objektiv durch ein wasserimmersionsbasiertes 40x-Objektiv ersetzt.Ohne den Tisch zu bewegen, wird das digitale Bild der Ansicht aufgenommen. Erneut werden die Koordinaten des Tischmanipulators auf null gesetzt. Wir verwenden Scan Image als Software zur Bildaufnahme.Dies wurde in MATLAB von Tom Paul Rudo und Bernardo Sabatini im Labor von Carls Voto geschrieben. Anschließend schalten wir alle weiteren Geräte ein, den Laser, das Leistungsmessgerät, die Photomultiplierröhren, die Verstärker und so weiter. Der für die Abbildung geeignete Bereich des Fensters wird kurz bei niedriger Vergrößerung abgetastet, um die besten Regionen zu finden.Nach deren Identifizierung wird der Aufnahmestapel der ausgewählten Region mit niedriger Vergr&ouml;&szlig;erung angefertigt und ihre XY-Koordinaten werden annotiert, um die Dynamik des Blutflusses in kleinen Gef&auml;&szlig;en oder Kapillaren aufzuzeichnen. Wir verwenden Linienabtastungen entlang von mindestens 40 Mikrometern des interessierenden Gef&auml;&szlig;es. Diese einzelnen Abtastvorg&auml;nge, die eine Sekunde dauern, werden mit m&ouml;glichst geringer Laserleistung durchgef&uuml;hrt, und die Koordinaten sowie der Scannenwinkel werden notiert.Nach Beendigung der Bildgebungssitzung wird das Tier in eine warme Kammer verbracht, in der es sich von der Anästhesie erholen kann. Hier zeigen wir einen Stapel von hundert Bildern, die im Abstand von jeweils fünf Mikrometern mit unserem Zwei-Photonen-Mikroskop durch ein Schädel Fenster über dem somatosensorischen Kortex einer fünf Monate alten Maus aufgenommen wurden, der über die Schwanzvene mit r-Domine-Dextran injiziert worden war. Diese Bildsequenz zeigt das komplexe Netzwerk aus großen und kleinen Blutgefäßen, einschließlich der Kapillaren.Wir haben Ihnen soeben eine Methode zur Visualisierung der Blutflussdynamik in vivo durch ein Schädel Fenster gezeigt. Dies ist eine äußerst leistungsfähige Methode zur Abbildung der zerebralen Blutflussdynamik in der kortikalen Gefäßversorgung, beispielsweise um Veränderungen des Blutflusses nach einem Schlaganfall zu untersuchen. Mehrere Aufnahmen können zu verschiedenen Zeitpunkten in BULs durch wiederholte Injektionen des fluoreszierenden Farbstoffs in die Schwanzvene durchgeführt werden.Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, stets unter den saubersten und sterilsten Bedingungen zu arbeiten und eine sehr ruhige Hand zu haben. Gut, das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihrem Experiment.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Video-und Protokoll zu demonstrieren, wie man ein Glas überdachten kranialen Fenster in Nagetieren zu implantieren. Diese Zubereitungen können bei chronischen in vivo Zwei-Photonen-Imaging des Neokortex über Zeitskalen von Monaten verwendet werden. Es kann auch für andere Arten der Bildgebung, darunter optische Eigensicherheit Signal Bildgebung verwendet werden.

Ein Kraniotomie Chirurgie Verfahren für chronische Brain Imaging

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Chronische Imaging of Mouse Visual Cortex Mit einem ausgedünnten Schädel Vorbereitung

Wir stellen eine Methode, um ein bildgebendes Fenster in der Maus, die Schädel Millimeter überspannt und ist seit Monaten ohne Entzündung des Gehirns stabil zu bilden. Diese Methode wird auch für longitudinale Studien des Blutflusses, Zelluläre Dynamik und Zell / vaskuläre Struktur mit zwei-Photonen-Mikroskopie geeignet.

Eine polierte und verstärkte ausgedünnten Schädel Fenster für Langzeit-Imaging im Gehirn der Maus

Quelle: Bisht, K., et al. Präzises Mapping des Gehirns zur Durchführung einer repetitiven In-vivo-Bildgebung der Neuroimmundynamik bei Mäusen. J. Vis. Exp. (2020)Dieses Video zeigt die Fluoreszenzbildgebung der Neuroimmundynamik in einer transgenen Maus mit einem Schädelimplantat. Die vaskuläre und neuronale Stabilität wird neben dynamischen Veränderungen der Mikroglia abgebildet, die die Immunreaktionen auf neuronale Aktivität widerspiegeln.

Fluoreszenzbildgebung der neuroimmunen Dynamik mit Hilfe eines Schädelimplantats

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Gezielte Labeling von Neuronen in einem bestimmten Functional Micro-Domäne des Neocortex durch Kombination Intrinsic Signal-und Zwei-Photonen-Imaging

Experience-abhängigen molekularen Veränderungen in Nervenzellen sind essentiell für die Fähigkeit des Gehirns, in Reaktion auf Verhaltensstörungen Herausforderungen anzupassen.

In Vivo Zwei-Photonen-Imaging Of Experience-abhängigen molekularen Veränderungen in kortikalen Neuronen

Wir beschreiben ein experimentelles Verfahren zur Messung der neuronalen Aktivität durch dual optische Fenster über bilaterale primären somatosensorischen Corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgene Mäuse mit 2-Photonen (2P) Mikroskopie in Vivo.

Neuronalen Aktivität im primären somatosensorischen Cortex mit Thy1Imaging-GCaMP6s transgene Mäuse

Wir präsentieren eine in Vivo zwei-Photon imaging-Protokoll für die Belichtung der Hirnrinde des Neugeborenen Mäusen. Diese Methode ist geeignet für die Analyse der Entwicklungs Dynamik der kortikalen Neuronen, die molekularen Mechanismen, die die neuronale Dynamik und die Veränderungen in der neuronalen Dynamik in Krankheitsmodellen steuern.

In Vivo Zwei-Photon Imaging der kortikalen Neuronen bei Neugeborenen Mäusen

Diese Studie zeigt die Verabreichung eines wiederholten Schädel-Hirn-Traumas an Mäuse und die gleichzeitige Implantation eines kranialen Fensters für die anschließende intravitale Bildgebung eines neuronenexprimierten EGFP mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie.

Intravitale Bildgebung der fluoreszierenden Proteinexpression bei Mäusen mit Schädel-Hirn-Trauma und Schädelfenster mit einem Zwei-Photonen-Mikroskop

Wir stellen einen neuartigen Ansatz für die Zwei-Photonen-Mikroskopie der Tumorabgabe von fluoreszenzmarkierten Eisenoxid-Nanopartikeln an das Glioblastom in einem Mausmodell vor.

Zwei-Photonen-Intravitalmikroskopie des Glioblastoms im Mausmodell

Erfahren Sie die Zweiphotonen-Mikroskopie zur Darstellung der Blutflussdynamik im Neocortex lebender Mäuse mittels fluoreszierender Dextran-Farbstoffe. Diese Methode ermöglicht chronische Bildgebung durch ein kraniales Fenster.

Eine Methode zur 2-Photonen-Imaging der Blutfluss in den Neocortex durch ein Cranial Fenster

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