Name: CRISPR-Cas9-basierte Mutagenese im entomopathogenen Nematoden Steinernema hermaphroditum und die Erhaltung mutanter Linien (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-12-30T12:55:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Lernen Sie CRISPR-Cas9-basierte Mutagenese im entomopathogenen Nematoden Steinernema hermaphroditum. Diese Methode ermöglicht funktionale Genanalysen und liefert Erkenntnisse über symbiotische Interaktionen.

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<ol><li>Stock, S., Blair, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entomopathogenic+nematodes+and+their+bacterial+symbionts%3A+The+inside+out+of+a+mutualistic+association%5BTitle%5D)+AND+%22Symbiosis%22%5BJournal%5D)">Entomopathogenic nematodes and their bacterial symbionts: The inside out of a mutualistic association.</a> Symbiosis. 46, 65-75 (2008).</li>
<li>Murfin, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nematode-bacterium+symbioses--cooperation+and+conflict+revealed+in+the+%26%2334%3Bomics%26%2334%3B+age%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Bull%22%5BJournal%5D)">Nematode-bacterium symbioses--cooperation and conflict revealed in the &#34;omics&#34; age.</a> Biological Bull. 223 (1), 85-102 (2012).</li>
<li>Dillman, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+entomopathogenic+nematode+by+any+other+name%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">An entomopathogenic nematode by any other name.</a> PLoS Pathog. 8 (3), e1002527(2012).</li>
<li>Cao, M., Schwartz, H. T., Tan, C. -H., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+entomopathogenic+nematode+Steinernema+hermaphroditum+is+a+self-fertilizing+hermaphrodite+and+a+genetically+tractable+system+for+the+study+of+parasitic+and+mutualistic+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The entomopathogenic nematode Steinernema hermaphroditum is a self-fertilizing hermaphrodite and a genetically tractable system for the study of parasitic and mutualistic symbiosis.</a> Genetics. 220 (1), iyab170(2022).</li>
<li>Sergeant, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification%2C+typing%2C+and+insecticidal+activity+of+Xenorhabdus+isolates+from+entomopathogenic+nematodes+in+United+Kingdom+soil+and+characterization+of+the+xpt+toxin+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification, typing, and insecticidal activity of Xenorhabdus isolates from entomopathogenic nematodes in United Kingdom soil and characterization of the xpt toxin loci.</a> Appl Environ Microbiol. 72 (9), 5895-5907 (2006).</li>
<li>Walsh, K. T., Webster, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+microbial+populations+in+Steinernema+%28Steinernematidae%2C+Nematoda%29+infected+Galleria+mellonella+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invertebr+Pathol%22%5BJournal%5D)">Interaction of microbial populations in Steinernema (Steinernematidae, Nematoda) infected Galleria mellonella larvae.</a> J Invertebr Pathol. 83 (2), 118-126 (2003).</li>
<li>Herbert, E. E., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Friend+and+foe%3A+The+two+faces+of+Xenorhabdus+nematophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Friend and foe: The two faces of Xenorhabdus nematophila.</a> Nat Rev Microbiol. 5 (8), 634-646 (2007).</li>
<li>Flores-Lara, Y., Renneckar, D., Forst, S., Goodrich-Blair, H., Stock, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+nematode+age+and+culture+conditions+on+morphological+and+physiological+parameters+in+the+bacterial+vesicle+of+Steinernema+carpocapsae+%28Nematoda%3A+Steinernematidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invertebr+Pathol%22%5BJournal%5D)">Influence of nematode age and culture conditions on morphological and physiological parameters in the bacterial vesicle of Steinernema carpocapsae (Nematoda: Steinernematidae).</a> J Invertebr Pathol. 95 (2), 110-118 (2007).</li>
<li>Cao, M., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ready+or+Not%3A+Microbial+adaptive+responses+in+dynamic+symbiosis+environments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Ready or Not: Microbial adaptive responses in dynamic symbiosis environments.</a> J Bacteriol. 199 (15), e00883-e00916 (2017).</li>
<li>Lacey, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+pathogens+as+biological+control+agents%3A+Back+to+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invertebr+Pathol%22%5BJournal%5D)">Insect pathogens as biological control agents: Back to the future.</a> J Invertebr Pathol. 132 (C), 1-41 (2015).</li>
<li>Campos-Herrera, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraspecific+virulence+of+entomopathogenic+nematodes+against+the+pests+Frankliniella+occidentalis+%28Thysanoptera%3A+Thripidae%29+and+Tuta+absoluta+%28Lepidoptera%3A+Gelechiidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nematol%22%5BJournal%5D)">Intraspecific virulence of entomopathogenic nematodes against the pests Frankliniella occidentalis (Thysanoptera: Thripidae) and Tuta absoluta (Lepidoptera: Gelechiidae).</a> J Nematol. 53 (1), 1-14 (2021).</li>
<li>Rill, A., Zhao, L., Bode, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+toolbox+for+Photorhabdus+and+Xenorhabdus%3A+pSEVA+based+heterologous+expression+systems+and+CRISPR%2FCpf1+based+genome+editing+for+rapid+natural+product+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Cell+Fact%22%5BJournal%5D)">Genetic toolbox for Photorhabdus and Xenorhabdus: pSEVA based heterologous expression systems and CRISPR/Cpf1 based genome editing for rapid natural product profiling.</a> Microb Cell Fact. 23 (1), 98(2024).</li>
<li>Ratnappan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi-mediated+gene+knockdown+by+microinjection+in+the+model+entomopathogenic+nematode+Heterorhabditis+bacteriophora%5BTitle%5D)+AND+%22Parasit+Vectors%22%5BJournal%5D)">RNAi-mediated gene knockdown by microinjection in the model entomopathogenic nematode Heterorhabditis bacteriophora.</a> Parasit Vectors. 9 (1), 160(2016).</li>
<li>Cao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+genome+editing+in+Steinernema+entomopathogenic+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 genome editing in Steinernema entomopathogenic nematodes.</a> bioRxiv. , (2023).</li>
<li>Heryanto, C., Ratnappan, R., O'Halloran, D. M., Hawdon, J. M., Eleftherianos, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+and+genetically+manipulating+entomopathogenic+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Culturing and genetically manipulating entomopathogenic nematodes.</a> J Vis Exp. (181), e63885(2022).</li>
<li>Stock, S. P., Griffin, C. T., Chaerani, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+molecular+characterisation+of+Steinernema+hermaphroditum+n.+sp.+%28Nematoda%3A+Steinernematidae%29%2C+an+entomopathogenic+nematode+from+Indonesia%2C+and+its+phylogenetic+relationships+with+other+members+of+the+genus%5BTitle%5D)+AND+%22Nematology%22%5BJournal%5D)">Morphological and molecular characterisation of Steinernema hermaphroditum n. sp. (Nematoda: Steinernematidae), an entomopathogenic nematode from Indonesia, and its phylogenetic relationships with other members of the genus.</a> Nematology. 6 (3), 401-412 (2004).</li>
<li>Bhat, A. H., Chaubey, A. K., Shokoohi, E., William Mashela, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+Steinernema+hermaphroditum+%28Nematoda%2C+Rhabditida%29%2C+from+West+Uttar+Pradesh%2C+India%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Study of Steinernema hermaphroditum (Nematoda, Rhabditida), from West Uttar Pradesh, India.</a> Acta Parasitol. 64 (4), 720-737 (2019).</li>
<li>Schwarz, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomes+of+the+entomopathogenic+nematode+Steinernema+hermaphroditum+and+its+associated+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Genomes of the entomopathogenic nematode Steinernema hermaphroditum and its associated bacteria.</a> bioRxiv. , (2025).</li>
<li>Haglund, K., Nezis, I. P., Stenmark, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+functions+of+stable+intercellular+bridges+formed+by+incomplete+cytokinesis+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Integr+Biol%22%5BJournal%5D)">Structure and functions of stable intercellular bridges formed by incomplete cytokinesis during development.</a> Commun Integr Biol. 4 (1), 1-9 (2011).</li>
<li>Ghanta, K. S., Ishidate, T., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+for+precision+genome+editing+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Microinjection for precision genome editing in Caenorhabditis elegans.</a> STAR Protoc. 2 (3), 100748(2021).</li>
<li>Gang, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+mutagenesis+in+a+human-parasitic+nematode%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Targeted mutagenesis in a human-parasitic nematode.</a> PLoS Pathog. 13 (10), e1006675(2017).</li>
<li>Adams, S., Pathak, P., Shao, H., Lok, J. B., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposome-based+transfection+enhances+RNAi+and+CRISPR-mediated+mutagenesis+in+non-model+nematode+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Liposome-based transfection enhances RNAi and CRISPR-mediated mutagenesis in non-model nematode systems.</a> Sci Rep. 9 (1), 483(2019).</li>
<li>Culp, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+in+the+nematode+Caenorhabditis+briggsae+using+the+CRISPR%2FCas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Methods+Protoc%22%5BJournal%5D)">Genome editing in the nematode Caenorhabditis briggsae using the CRISPR/Cas9 system.</a> Biol Methods Protoc. 5 (1), bpaa003(2020).</li>
<li>Hellekes, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+mediated+gene+editing+in+non-model+nematode+Panagrolaimus+sp.+PS1159%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genome+Ed%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 mediated gene editing in non-model nematode Panagrolaimus sp. PS1159.</a> Front Genome Ed. 5, 1078359(2023).</li>
<li>Patel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+generation+of+stable+transgenic+lines+in+the+human-infective+nematode+Strongyloides+stercoralis%5BTitle%5D)+AND+%22G3+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">The generation of stable transgenic lines in the human-infective nematode Strongyloides stercoralis.</a> G3 (Bethesda). 14 (8), jkae122(2024).</li>
<li>Moreno-Mateos, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPRscan%3A+Designing+highly+efficient+sgRNAs+for+CRISPR-Cas9+targeting+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">CRISPRscan: Designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo.</a> Nat Methods. 12 (10), 982-988 (2015).</li>
<li>Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+stable+transgenic+C.+elegans+using+microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection.</a> J Vis Exp. (18), e833(2008).</li>
<li>Wang, H., Park, H., Liu, J., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+genome+editing+strategy+to+generate+putative+null+mutants+in+Caenorhabditis+elegans+using+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22G3+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">An efficient genome editing strategy to generate putative null mutants in Caenorhabditis elegans using CRISPR/Cas9.</a> G3 (Bethesda). 8 (11), 3607-3616 (2018).</li>
<li>Conant, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inference+of+CRISPR+Edits+from+Sanger+Trace+Data%5BTitle%5D)+AND+%22CRISPR+J%22%5BJournal%5D)">Inference of CRISPR Edits from Sanger Trace Data.</a> CRISPR J. 5 (1), 123-130 (2022).</li>
<li>McMullen, J. G. 2nd, Stock, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+and+in+vitro+rearing+of+entomopathogenic+nematodes+%28Steinernematidae+and+Heterorhabditidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo and in vitro rearing of entomopathogenic nematodes (Steinernematidae and Heterorhabditidae).</a> J Vis Exp. (91), e52096(2014).</li>
<li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+co-CRISPR+strategy+for+efficient+genome+editing+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A co-CRISPR strategy for efficient genome editing in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 197 (4), 1069-1080 (2014).</li>
<li>Ciche, T. A., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postembryonic+RNAi+in+Heterorhabditis+bacteriophora%3A+A+nematode+insect+parasite+and+host+for+insect+pathogenic+symbionts%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Postembryonic RNAi in Heterorhabditis bacteriophora: A nematode insect parasite and host for insect pathogenic symbionts.</a> BMC Dev Biol. 7 (1), 101(2007).</li>
<li>Du, X., McManus, D. P., French, J. D., Jones, M. K., You, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9%3A+A+new+tool+for+the+study+and+control+of+helminth+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9: A new tool for the study and control of helminth parasites.</a> Bioessays. 43 (1), e2000185(2021).</li>
<li>Quinzo, M. J., Perteguer, M. J., Brindley, P. J., Loukas, A., Sotillo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenesis+in+parasitic+helminths%3A+A+brief+history+and+prospects+for+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Parasit+Vectors%22%5BJournal%5D)">Transgenesis in parasitic helminths: A brief history and prospects for the future.</a> Parasit Vectors. 15 (1), 110(2022).</li>
<li>Schwartz, H. T., Tan, C. -H., Peraza, J., Raymundo, K. L. T., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+identification+of+a+peroxidase+gene+controlling+body+size+in+the+entomopathogenic+nematode+Steinernema+hermaphroditum%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Molecular identification of a peroxidase gene controlling body size in the entomopathogenic nematode Steinernema hermaphroditum.</a> Genetics. 226 (2), (2024).</li>
<li>Dokshin, G. A., Ghanta, K. S., Piscopo, K. M., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+genome+editing+with+short+single-stranded+and+long%2C+partially+single-stranded+DNA+donors+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Robust genome editing with short single-stranded and long, partially single-stranded DNA donors in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 210 (3), 781-787 (2018).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Agar (80-100 Mesh)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP26411</td><td>Verwendet auch in LB Pyruvatplatten</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Fisher Scientific</td><td>16500500</td><td>Verwendet auch im Genotypisierungsverfahren</td></tr><tr><td>Alt-R CRISPR-Cas9 TracrRNA</td><td>IDT</td><td>1072532</td><td></td></tr><tr><td>Alt-R S.p. Cas9-Nuklease V3</td><td>IDT</td><td>1081058</td><td></td></tr><tr><td>Borosilikatnadeln</td><td>Welt-Präzisionsinstrument</td><td>1B120F-4</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid (CaCl2)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterin&nbsp;</td><td>VWR</td><td>433</td><td>5 mg/mL in Ethanol</td></tr><tr><td>Comamonas aquatica (DA1877)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Abdeckglas für Agarose-Pad</td><td>Hirnforschungslabore</td><td>#4860-1D</td><td>48 x 60 mm Dicke Nr1</td></tr><tr><td>CRISPRScan</td><td></td><td></td><td>https://www.crisprscan.org/</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>472301</td><td>0,5 M</td></tr><tr><td>DNA Clean und Concentrator-5&nbsp;</td><td>Zymo-Forschung</td><td>D4014</td><td></td></tr><tr><td>FemtoJet 4x Mikroinjektor mit Griffkopf-Set 4 Größe 0 Nadelhalter</td><td>Eppendorf/Calibre</td><td>5253000017</td><td></td></tr><tr><td>Larven von Galleria melonella 5. Stadium</td><td>GrubCo</td><td></td><td>https://www.grubco.com/index.cfm</td></tr><tr><td>Gelbildgebungssystem</td><td>Azure400</td><td>AZI400-01</td><td></td></tr><tr><td>Gel-Ladefarbe</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B72</td><td></td></tr><tr><td>Gelatine (2 %)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1393</td><td></td></tr><tr><td>GelRed</td><td>Biotium</td><td>#41003</td><td></td></tr><tr><td>Genotypisierungsprimer: DNA-Oligo, 25 nmol</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Bacto Peptone</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0118-17-0</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Bacto Trypton</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0123-17-3</td><td>Verwendet auch in Dark LB, LB Pyruvatplatten&nbsp;</td></tr><tr><td>Gibco Bacto Hefeextrakt</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0127-17-9</td><td>Verwendet auch in Dark LB, LB Pyruvatplatten&nbsp;</td></tr><tr><td>Griffkopf-Set 4 Größe 1 Nadelhalter</td><td>Kaliber</td><td>EPE-5196083008</td><td>(in Kombination mit Borosilikatnadel 1B120F-4)</td></tr><tr><td>Halocarbonöl 700</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H8898</td><td></td></tr><tr><td>Hartplatin-Drahtwurmpickel für die tägliche Pflege</td><td>Tritech-Forschung</td><td>PT-9901</td><td></td></tr><tr><td>Schlussfolgerung von CRISPR-Bearbeitungen (ICE)</td><td>Synthego</td><td>N/A</td><td>Software, die zur Analyse von Sanger-Sequenzen zur Identifizierung von Indels verwendet wird</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Laser-Nadelzieher P-2000</td><td>Sutter</td><td>P-2000G</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid (MgCl2)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumsulfat (MgSO4)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7506</td><td>Für den M9-Puffer, auch in NGM verwendet.</td></tr><tr><td>Microloader-Tipp 2x96ST</td><td>Kaliber</td><td>930001007</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator-Montageadapter für Zeiss Axio Observer und Axiovert 200</td><td>Tritech-Forschung</td><td>NZ-19-2</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Tritech</td><td>SMT1</td><td></td></tr><tr><td>Nikotin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N3876</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>85124</td><td></td></tr><tr><td>Nukleasefreier Duplexpuffer</td><td>IDT</td><td>11-01-03-01</td><td></td></tr><tr><td>OneTaq MasterMix</td><td>NEB</td><td>M0486</td><td></td></tr><tr><td>Pipettenaufbewahrungsbox</td><td>Sutter-Instrumente</td><td>BX10</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid (KCl)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>793590</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumphosphat, dibasisch (K2HPO4)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3786</td><td>KOH für NGM</td></tr><tr><td>Kaliumphosphat, monobasisch (KH2PO4)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5655</td><td>Für den M9-Puffer, auch in NGM verwendet.</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6556</td><td></td></tr><tr><td>Quarznadeln</td><td>Sutter-Instrumente</td><td>QF100-70-10</td><td></td></tr><tr><td>S. hermaphroditium Genom</td><td>NCBI</td><td></td><td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/datasets/genome/GCA_030435675.1/</td></tr><tr><td>sh-unc-22 Alt-R CRISPR-Cas9 crRNAs</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid (NaCl)</td><td>VWR</td><td>SS0430</td><td>Verwendet auch in M9, Dark LB, LB Pyruvate Plates</td></tr><tr><td>Natriumphosphat, dibasisch (Na2HPO4,7H20)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9390</td><td>Für den M9-Puffer</td></tr><tr><td>Natriumpyruvat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2256</td><td>Verwendet auch in LB-Pyruvatplatten&nbsp;</td></tr><tr><td>Weicher Platin-Drahtwurmpickel für Mikroinjektion</td><td>Surepure Chemetals</td><td>6824</td><td>Platin 90 %, Iridium 10 % Legierungsdraht, 0,002 Zoll Durchmesser x 5 Fuß lang</td></tr><tr><td>Standardnadelhalter</td><td>Tritech-Forschung</td><td>HI-7</td><td></td></tr><tr><td><>Steinernema hermaphroditum</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Leica</td><td>Inveta 3</td><td></td></tr><tr><td>Trehalose</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-88195-99</td><td>0,08 m</td></tr><tr><td>Tris&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM9855G</td><td>pH 8,0</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Vertikaler Mikromanipulator-Montageadapter</td><td>Tritech-Forschung</td><td>NR2</td><td></td></tr><tr><td>Xenorhabdus griffiniae (HGB2511)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

crispr-cas9-basierte mutagenese im entomopathogenen nematoden steinernema hermaphroditum und die erhaltung mutanter linien

CRISPR-Cas9-based Mutagenesis in the Entomopathogenic Nematode Steinernema hermaphroditum and the Maintenance of Mutant Lines

CRISPR-Cas9-basierte Mutagenese im entomopathogenen Nematoden Steinernema hermaphroditum und die Erhaltung mutanter Linien

Entomopathogenic nematodes (EPNs) in the genus Steinernema and Heterorhabditis maintain mutualistic interactions with Xenorhabdus and Photorhabdus ...

Wir arbeiten an der Genetik der Symbiose der Nematodenbakterien, die landwirtschaftliche Anwendungen hat. Genetische Werkzeuge bei Xenorhabdus-Bakterien sind sehr gut entwickelt, aber die EPN-Genetik bleibt begrenzt und stützt sich hauptsächlich auf RNAi- und EMS-Screens. Zu Beginn sollten Sie Nematoden-Agarplatten erwerben, die mit Xenorhabdus griffiniae und Comamonas aquaticus besetzt sind.Nehmen Sie Steinernema hermaphroditum-Nematoden auf die vorbereiteten NGM-Platten mit Xenorhabdus griffiniae. Inkubieren Sie sie bei 25 bis 28 Grad Celsius für optimales Wachstum. Am Abend vor der Mikroinjektion nehmen Sie J3-Hermaphroditen auf frische NGM-Agarplatten, die mit Xenorhabdus griffiniae besät sind.Am Tag der Mikroinjektion wählen Sie junge erwachsene Hermaphroditen zur Injektion aus. Extrahiere die Zielgensequenz aus dem Steinernema-Hermaphroditum-Referenzgenom mit BlastP. Wählen Sie ein frühes kodierendes Exon, vorzugsweise das erste Exon, und geben Sie die Sequenz mit den Standardeinstellungen in CRISPRscan ein, um Kandidaten-CRISPR-RNAs zu erzeugen.Sprengen Sie die besten CRISPR-RNAs gegen das Steinernema-Hermaphroditum-Genom, um sicherzustellen, dass es keine Off-Target-Übereinstimmungen gibt. Speichern Sie die ausgewählten CRISPR-RNAs und universelle transaktivierende CRISPR-RNAs jeweils bei 100 Mikromolaren in einem Duplexpuffer bei minus 80 Grad Celsius. Schmelze 2 % Agarose in Wasser mit einer Mikrowelle.Übertragen Sie 50 Mikroliter der geschmolzenen Agarose auf ein Deckglas. Decken Sie es sofort mit einem zweiten Deckglas ab. Nach einer 20-minütigen Trocknungszeit entfernen Sie das obere Deckglas und beschriften Sie dann die Vorderseite des Agarose-Pads.Lagern Sie die Agarose-Pads bei Zimmertemperatur für den langfristigen Gebrauch über Monate bis Jahre. Um die Nadeln für die Injektion vorzubereiten, ziehen Sie Quarzkapillaren an einem Laserfilamentzieher und bewahren Sie die Nadeln in einer Pipettenaufbewahrungsbox auf. Bereite frische Guide-RNA-Duplexe vor, indem du die ausgewählten crRNAs und universell transaktivierende CRISPR-RNAs in einem Eins-zu-eins-Verhältnis mischst.Inkubieren Sie das Rohr bei 94 Grad Celsius für zwei Minuten, dann kühlen Sie auf Raumtemperatur ab, um Duplexe zu annealisieren. Setzen Sie die Injektionsmischung zusammen, indem Sie Cas9, Kaliumchlorid und die gRNA duplexen und inkubieren. Dreimal das PCR-Röhrchen zum Mischen bewegen, dann kurz 10 bis 15 Sekunden in einer Mini-Zentrifuge drehen.Nach dem endgültigen Mischen bis zu einer Minute drehen, um den Inhalt zu sammeln. Als Nächstes verwenden Sie eine Microloader-Spitze, um ein bis zwei Mikroliter Injektionsmischung in die Nadel zu geben. Befestigen Sie die Nadel am Halter, brechen Sie die Spitze auf, indem Sie über doppelseitiges Klebeband unter Halocarbonöl ziehen.Und die Größe der Öffnung mit der Reinigungsfunktion des Mikroinjektors zu testen. Lege einen kleinen Tropfen Halokarbonöl auf das 2%-Agarose-Pad. Mit einem Seziermikroskop und einem weichen Platindraht nehmen Sie einen jungen erwachsenen Hermaphroditen auf.Wasche es in M9-Puffer, um die Bakterien zu entfernen. Übertragen Sie den Nematoden auf ein Agarose-Pad und legen Sie ihn in einen Tropfen mit Halokarbonöl. Benutze den weichen Platindraht, um den Nematoden vorsichtig zu bürsten, bis er bewegungsunfähig ist.Montiere das Pad auf der Mikroinjektionsstufe. Suchen Sie einen Gonadenarm und stoßen Sie mit der Nadel in ihn. Verwenden Sie die Reinigungsfunktion des Injektors, um die Injektionsmischung mit 99 Pfund pro Quadratzoll zu liefern, bis der Gonadenfluss sichtbar ist und so den Zugang des Reagens zum Synzytium bestätigt.Wenn zugänglich, versetzen Sie die Stufe neu und injizieren Sie den zweiten Gonadenarm auf ähnliche Weise. Unmittelbar nach der Injektion wird das injizierte Tier in ein bis zwei Mikroliter M9-Puffer auf dem Agarose-Pad wieder suspendiert. Benutze einen dünnen Platindraht, um den eingespritzten Wurm vom Pad zu nehmen, wasche dann das Öl mit M9-Puffer ab und hole es auf der mit Comamonas aquatica besäten NGM-Platte zurück.Inkubieren Sie die Erholungsplatte über Nacht bei 25 Grad Celsius. Am nächsten Tag isoliert man jeden injizierten P0-Nematoden auf einzelne NGM-Platten, die mit Xenorhabdus griffiniae ausgesät sind. Zwei CRISPR-RNAs wurden entwickelt, die den Steinernema-Hermaphroditum-Homolog von unc-22 an zuvor veröffentlichten PAM-Stellen anvisieren.Die Jerk-Analyse von Nikotin-Nematoden zeigte deutliche Bewegungsunterschiede zwischen unc-22-Mutanten und Wildtyp-Nematoden. Die Genotypisierung von zuckenden Nachkommen mittels PCR zeigte mehrere schwache Bänder an der Zielstelle sowohl für Pam 3 als auch Pam 5. Die Sequenzierung bestätigte Einfügungs- und Löschereignisse an der angevisierten unc-22-Stelle.Mein Labor hat meine Postdoktorandenarbeit in der EPN-Genetik erweitert. CRISPR ist jetzt in drei Steinernema-Arten erhältlich. In diesem Protokoll etablierten wir eine effiziente Technik, um stabile, erbbare Mutanten mittels CRISPR-Cas9-Gen-Editierung zu erzeugen.Mit stabiler CRISPR-Cas9-Geneditierung können wir die molekularen Mechanismen hinter der Steinernema-Xenorhabdus-Symbiose analysieren.

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Forschung

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CRISPR/Cas9-Editierung des C. elegans rbm-3.2-Gens mit dem dpy-10 Co-CRISPR Screening Marker und Assembled Ribonucleoprotein Complexes.

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Embryo-Mikroinjektion und Knockout-Mutanten-Identifizierung von CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera (Hübner)

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Konstruktion homozygoter Mutanten der Wanderheuschrecke mittels CRISPR/Cas9-Technologie

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Kultivierung und genetische Manipulation entomopathogener Nematoden

Lernen Sie CRISPR-Cas9-basierte Mutagenese im entomopathogenen Nematoden Steinernema hermaphroditum. Diese Methode ermöglicht funktionale Genanalysen und liefert Erkenntnisse über symbiotische Interaktionen.

CRISPR-Cas9-basierte Mutagenese im entomopathogenen Nematoden Steinernema hermaphroditum und die Erhaltung mutanter Linien

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