Generación de células dendríticas derivadas de la médula ósea: un método para generar células dendríticas a partir de médula ósea de ratón

- Las células dendríticas o CD son células presentadoras de antígenos clave que activan las células T. En los pacientes leucémicos, estas células expresan mal el antígeno asociado al tumor y no logran provocar una respuesta inmunitaria específica del antígeno. Las células dendríticas son abundantes en la médula ósea. Y por lo tanto, la médula ósea es el sitio preferido para su aislamiento para ayudar a estudiar su papel en el cáncer.

Para obtener células dendríticas, extraiga la médula ósea del fémur o la tibia de un ratón sacrificado mediante el uso de una jeringa llena de medios para enjuagarla. Centrifugar y resuspender el pellet en tampón de cloruro-potasio o ACK para lisar eritrocitos. Ahora agregue medios de cultivo para detener la lisis y centrifugar. Vuelva a suspender el pellet en el medio de cultivo que contiene un antibiótico. Agregue el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos o GM-CSF, y transfiera la suspensión celular a una placa de Petri.

Incube la placa durante el tiempo deseado. El GM-CSF ayuda a las células progenitoras a diferenciarse en células dendríticas. Finalmente, activa las células con lipopolisacáridos o LPS, que se unen al receptor de superficie de las células dendríticas, lo que da como resultado células dendríticas de médula ósea completamente maduras e inmunogénicas. En este protocolo, demostraremos la generación de células dendríticas a partir de la médula ósea del ratón.

- Para generar células dendríticas derivadas de la médula ósea, se aísle la médula ósea de los fémures de ratones knockout de tipo salvaje o Factor B, como se ha demostrado, y lise los glóbulos rojos en 5 mililitros de tampón de lisis ACK, deteniendo la reacción con 10 mililitros de RPMI, suplementado con FBS al 1% después de cinco minutos.

Después de recolectar las células sanguíneas enteras por centrifugación, vuelva a suspender el pellet en 10 mililitros de medio de cultivo a una concentración de 2 veces 10 a 6 células por mililitro y agregue 20 nanogramos por mililitro de GM-CSF a las células, antes de sembrar 10 mililitros de células en placas de Petri individuales de 100 por 15 milímetros a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante seis días. En el sexto día, active los cultivos de células dendríticas derivadas de la médula ósea con 25 microgramos por mililitro de LPS por placa.