Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Neuroscience
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Comience con un cultivo primario del mesencéfalo de embriones de rata, que contiene neuronas dopaminérgicas que sobreexpresan alfa-sinucleína mutada.
Reemplace los medios en los pocillos de tratamiento con medios nuevos que contengan el compuesto de prueba, y los de los pocillos de control con medios simples. Luego incuba.
En el control, la alfa-sinucleína forma agregados tóxicos en las neuronas dopaminérgicas, causando retracción de neuritas y provocando la muerte neuronal.
En el tratamiento, el compuesto de prueba interactúa con la alfa-sinucleína, previene su agregación, preserva la estructura de la neurita y proporciona neuroprotección.
Fije y permeabilice las células, luego bloquee los sitios de unión no específicos.
Incubar con anticuerpos primarios para marcar todas las neuronas, con etiquetado adicional para neuronas dopaminérgicas.
Lave las células y agregue anticuerpos secundarios marcados con fluoróforo específicos para los anticuerpos primarios.
Usando un microscopio de fluorescencia invertida, cuente las neuronas dopaminérgicas marcadas diferencialmente, luego cambie a un microscopio confocal para medir la longitud de la neurita.
Un mayor recuento de neuronas dopaminérgicas con neuritas intactas en el tratamiento en comparación con los controles confirma el potencial neuroprotector del compuesto de prueba.