Inducción de la diferenciación de Vibrio parahaemolyticus en células de enjambre

Comience con un medio de agar fundido que apoye el crecimiento bacteriano.

Agregue un quelante de hierro para agotar el hierro libre y complemente el medio con calcio.

Vierta el medio en un plato, deje que se solidifique y luego séquelo para eliminar la humedad residual.

Tome un caldo de cultivo de Vibrio parahaemolyticus, una bacteria flagelada.

En medios líquidos, las bacterias existen en una forma de nadador corta en forma de varilla con un flagelo.

Coloque el cultivo en la placa y déjelo secar para promover el contacto bacteriano con la superficie.

Selle el plato e incube, permitiendo que se acumulen los subproductos metabólicos volátiles de las bacterias.

El contacto con la superficie, la limitación del hierro, la disponibilidad de calcio y los subproductos acumulados inducen la expresión génica, lo que desencadena la diferenciación en células de enjambre alargadas que contienen flagelos laterales, lo que permite el movimiento a través de superficies sólidas.

Las células del enjambre se expanden hacia afuera y forman llamaradas de enjambre compuestas de células completamente diferenciadas, lo que indica una diferenciación exitosa.

Para preparar la solución de agar para hacer placas de enjambre, suspenda cuatro gramos de infusión de corazón o polvo de agar H. I. y 100 mililitros de agua doblemente destilada.

Hervir con cuidado la solución de agar H. I. en un horno microondas, agitando la botella de vez en cuando hasta que el polvo se disuelva. Autoclave la solución de agar a 121 grados Celsius durante 20 minutos, enfríe la solución de agar a 60 a 65 grados Celsius con agitación constante. El siguiente paso consiste en manipular 2, 2'-Bipyridyl, que es altamente tóxico, por lo que se deben usar guantes y gafas de seguridad.

Agregue 2, 2'-Bipyridyl a una concentración final de 50 micromolares. Agregue cloruro de calcio a una concentración final de cuatro milimolares. Inocular una pequeña cantidad de células de V. parahaemolyticus desde el borde de una sola colonia en 5 mililitros de caldo LB.

Incubar el cultivo a 37 grados centígrados en una incubadora agitadora hasta que alcance una densidad óptica de 600 nanómetros de 0,8. Esto suele tardar entre dos y tres horas. Mientras crece el cultivo celular, pipetee de 30 a 35 mililitros de la solución final de agar H. I. en una placa de Petri redonda de 150 milímetros y deje que el agar se solidifique.

Justo antes de detectar el cultivo celular, seque la placa de agar en posición vertical con una tapa abierta a 37 grados centígrados durante al menos 10 minutos, o hasta que hayan desaparecido los residuos líquidos, pero no más. Coloque un microlitro de cultivo celular en el centro de la placa de enjambre de agar H. I. y deje que la mancha se seque. Selle la placa con cinta de plástico transparente, teniendo cuidado de evitar la formación de burbujas de aire y pliegues en la cinta.

Incube la placa a 24 grados centígrados durante la noche. Esto dará como resultado la formación de una colonia de enjambre de V. parahaemolyticus con llamaradas de enjambre que se extienden desde el centro de la colonia, como se muestra en este videoclip de lapso de tiempo.