Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Microbiology
0 visualizaciones • 2:28 min. • September 26th, 2025
Comience con un cultivo de E. coli aislado de recién nacidos con infecciones del torrente sanguíneo.
Centrifugar para granular las bacterias, desechar el sobrenadante y volver a suspender el pellet en un medio libre de antibióticos.
Tome un plato con un inserto transwell que contenga una monocapa de células epiteliales intestinales.
Mida la resistencia eléctrica a través de la capa celular con una sonda para confirmar la integridad de la monocapa.
Agregue la suspensión bacteriana en el inserto e incube.
Las bacterias se adhieren a las células epiteliales, se internalizan dentro de las vesículas y se transportan a través de las células al pozo inferior a través de un proceso llamado transcitosis.
Mida la resistencia eléctrica nuevamente; Un valor estable confirma una monocapa intacta durante la transcitosis.
Transfiera el inserto a un pocillo nuevo y recoja el medio del pocillo inferior anterior.
Coloque el medio recolectado en una placa de agar e incube para desarrollar las colonias bacterianas.
Cuente las colonias para determinar la extensión de la transcitosis de E. coli a través de la barrera epitelial intestinal.
Cada 30 minutos después de la inoculación, llene los nuevos pocillos con 500 microlitros de MTC sin antibióticos y transfiera los insertos a estos nuevos pocillos. Recoja los medios del pozo colector usado para cada inserto en un tubo etiquetado por separado y coloque el tubo sobre hielo. Regrese la placa Transwell a la incubadora entre puntos de tiempo.
Para cada inserto, combine los medios recolectados de diferentes puntos de tiempo y vórtice brevemente. Coloque los medios recolectados en placas de barrena LB utilizando el método de dilución de pistas para cuantificar el número de bacterias transcitosas en las primeras dos horas del experimento. Recoge los medios a las cuatro y seis horas.
Además, a las seis horas, coloque el medio en placas de los pocillos de control. A las seis horas, mida y registre el TEER. Después de la incubación durante la noche, cuente las colonias bacterianas manualmente en las placas LB de dilución de pista.