Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Microbiology
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Tome un cultivo de S. aureus sensible al antibiótico cloranfenicol.
Centrifugar para granular las bacterias y eliminar el sobrenadante.
Transfiera el gránulo a un tubo que contenga medios limitadores de nutrientes e incube. El estrés nutricional mejora la competencia: la capacidad de la bacteria para internalizar ADN extraño.
Centrifugar de nuevo y retirar el sobrenadante. Vuelva a suspender el gránulo en un medio nuevo limitante de nutrientes.
A continuación, agregue ADN extraído de una cepa de S. aureus que lleva un gen resistente al cloranfenicol. Incubar.
La maquinaria de captación de ADN procesa el ADN en una sola hebra y lo transloca al citoplasma, donde se integra en el cromosoma bacteriano.
Centrifugar y eliminar el sobrenadante. Vuelva a suspender el gránulo en medios ricos en nutrientes.
Transfiera la suspensión a agar fundido rico en nutrientes que contenga cloranfenicol.
Vierta la mezcla en un plato e incube.
El crecimiento de colonias resistentes al cloranfenicol indica una absorción exitosa del ADN.
Cultive la célula receptora durante la noche, en cinco mililitros de TSB a 37 grados centígrados con agitación. A la mañana siguiente, transfiera 0,5 mililitros del cultivo nocturno a un tubo de 1,5 mililitros.
Precipitar las células por centrifugación. Luego suspenda las celdas con 10 mililitros de medio CS2 en un tubo de 50 mililitros. A continuación, cultive las bacterias a 37 grados centígrados agitándolas a 180 rotaciones por minuto durante ocho horas hasta la fase exponencial tardía.
Cosecha las células por centrifugación. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 10 mililitros de medio CS2 fresco. Agregue 10 microgramos de plásmido purificado o ADN genómico a la suspensión celular.
Agite el cultivo a 180 rotaciones por minuto. Luego recolecte las células por centrifugación. Resuspender las células en 10 mililitros de medio BHI.
Mezcle la suspensión celular con 90 mililitros de suplemento de agar BHI derretido con 32 miligramos por litro de cloranfenicol y cinco microgramos por litro de tetraciclina en el experimento de control. Vierta la mezcla en las placas de Petri de 90 milímetros y enfríe rápidamente y deje que el agar se solidifique. Replique las colonias usando palillos de dientes en placas que contengan antibióticos apropiados para confirmar sus características de resistencia.