Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Microbiology
0 visualizaciones • 3:28 min. • October 30th, 2025
Comience con una solución de resina de intercambio iónico que contenga grupos funcionales cargados positivamente para la unión selectiva de proteínas.
A continuación, tome un extracto de proteína obtenido de células bacterianas huésped diseñadas para sobreexpresar un factor de virulencia de la bacteria patógena Helicobacter pylori.
El extracto contiene el factor de virulencia objetivo junto con proteínas de la célula huésped en un tampón a pH 8.
Mezclar el extracto proteico con la resina e incubar con agitación para asegurar una interacción proteína-resina uniforme.
Las proteínas del huésped, que tienen puntos isoeléctricos más bajos que el pH del tampón, se cargan negativamente y se unen a la resina cargada positivamente.
La proteína diana, con un punto isoeléctrico cercano al pH del tampón, permanece en gran parte sin carga y permanece sin unir.
Transfiera la suspensión de proteína y resina a una columna de cromatografía y deje que la resina se asiente.
Recoja la fase líquida que contiene la proteína diana no unida.
Enjuague la resina con el tampón para asegurar la máxima recuperación de la proteína objetivo.
Para preparar 15 mililitros de resina DEAE, suspenda 0,6 gramos de polvo seco de resina DEAE en 30 mililitros de tampón Tris-HCl a temperatura ambiente durante al menos un día.
Centrifugar la resina a 10.000 veces g a cuatro grados centígrados durante un minuto y luego retirar y desechar el sobrenadante. Luego, agregue 15 mililitros de tampón Tris-HCl. Después de repetir la centrifugación, los pasos de resuspensión cuatro veces más, almacene los 15 mililitros de resina sedimentada a cuatro grados centígrados para su uso posterior.
Trabajando a cuatro grados centígrados, agregue 45 mililitros de las proteínas solubles preparadas a 15 mililitros de la resina y transfiéralas a un vaso de precipitados de 100 mililitros con barra de agitación. Revuelva la suspensión de resina proteica con una placa de agitación a cuatro grados centígrados durante una hora. A continuación, vierta la suspensión de resina proteica en una columna de plástico o vidrio equipada con una llave de paso y deje que la resina se asiente por gravedad.
Abra la llave de paso para permitir que la solución de proteína corra a través de la columna por flujo de gravedad hasta que el nivel de líquido en la columna esté justo por encima de la resina. Recoge el flujo como la fracción no unida que contiene la proteína activadora de neutrófilos purificada. Agregue 15 mililitros del tampón Tris-HCl helado a la columna.
Abra la llave de paso nuevamente para permitir que el tampón de lavado atraviese la columna por flujo de gravedad hasta que el nivel de líquido en la columna esté justo por encima de la resina. Recoge el flujo como fracción de lavado. Repita el lavado con tampón helado cuatro veces más para recoger las fracciones de lavado adicionales.