Un enfoque basado en cromatografía líquida–espectrometría de masas para analizar metabolitos de S. aureus

Comienza con Staphylococcus aureus suspendido en una solución de temple que contiene perlas de sílice, almacenadas a baja temperatura para preservar su estado metabólico.

Homogeneizar las bacterias en condiciones frías para liberar contenido intracelular minimizando la degradación enzimática de los metabolitos.

Centrifuga el lisado y cosecha el supernadante rico en metabolitos.

Añade un disolvente orgánico al extracto y al vórtice para precipitar macromoléculas a partir de metabolitos solubles.

Centrifugar para pelletar el precipitado y transferir el sobrenadante a viales.

Carga los viales en un sistema de cromatografía líquida-espectrometría de masas.

Dentro de la columna de cromatografía, los metabolitos interactúan con la fase sólida estacionaria según sus propiedades químicas.

Añade un tampón para eluir los metabolitos. Luego, dirige los metabolitos hacia la fuente de ionización por electrospray del espectrómetro de masas para ionizarlos.

Los iones se separan entonces según su relación masa-carga.

Los datos resultantes se comparan con una base de datos de referencia para identificar los metabolitos.

Para comenzar la extracción del metabolito, primero descongela las muestras sobre hielo húmedo. Luego se alteran las celdas en un homogeneizador con cuatro ráfagas de 30 segundos a 6000 rpm, con periodos de enfriamiento de dos minutos sobre hielo seco entre ciclos.

Clarifica los lisados durante 15 minutos en un tubo de microcentrífuga refrigerado preenfriado a máxima velocidad. Tras la centrifugación, transfiere el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga limpio. Utilizando una micropipeta, transfiere una pequeña porción de la muestra a un tubo microcentrífuga para cuantificar el contenido residual de péptidos tal y como se describe en el protocolo de texto.

Guarda el resto de la muestra a menos 80 grados Celsius. Consulte el protocolo de texto para el análisis de los metabolitos mediante cromatografía líquida y espectrometría de masas.