Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Biological Techniques
0 visualizaciones • 3:37 min. • July 8th, 2025
Los osteoblastos son células formadoras de hueso que secretan pequeñas vesículas en su matriz extracelular, ECM. Estas vesículas, llamadas vesículas de matriz, están equipadas con transportadores de membrana y enzimas que permiten la entrada de iones de calcio y fosfato, formando cristales minerales en su interior. A medida que los cristales se acumulan, atraviesan la membrana de la vesícula para formar nódulos mineralizados en la ECM, formando la densidad mineral ósea.
Para visualizar la mineralización, comience con células osteoblásticas en un andamio biocompatible en un medio de crecimiento adecuado. Los osteoblastos se adhieren al andamio y utilizan factores de crecimiento del medio para secretar vesículas de matriz que posteriormente forman nódulos mineralizados en la MEC.
Aspire el medio de cultivo y enjuague las células para eliminar cualquier rastro de medio. Trate las células con una solución de formalina, que induce la reticulación, la fijación y la preservación de la estructura tisular de la ECM. Lave las celdas para eliminar cualquier resto de formalina.
A continuación, agregue la solución de tinción Alizarin Red e incube el cultivo. Las moléculas de colorante se unen al nódulo mineralizado y se asocian con el calcio, un mineral óseo clave, formando grandes complejos teñidos.
Aspire la solución de tinción y lávela bien para eliminar cualquier tinte desligado. Cuando se observan bajo un microscopio, los depósitos minerales ricos en calcio aparecen como nódulos de color rojo brillante en la MEC, lo que indica mineralización por parte de los osteoblastos.
Aspirar medio de cultivo de osteoblastos primarios, 14 días después de la adición del medio de mineralización osteogénica. Enjuague dos veces con 0,5 mililitros de 1X PBS. Luego, fije las células agregando 0,5 mililitros de solución de formalina tamponada al 10% e incubando a temperatura ambiente durante 10 minutos. Después de 10 minutos, aspire la formalina tamponada al 10% con una pipeta de un solo uso y lave dos veces con 0,5 mililitros de agua ultrapura. Luego, agregue 250 microlitros de solución de tinción de rojo de alizarina S de 40 milimolares a los osteoblastos fijos e incube la placa a temperatura ambiente durante 10 minutos en un agitador a 100 batidos por minuto.
Después de la incubación con solución de tinción, aspire la solución de tinción con una pipeta de un solo uso y enjuague con 1 mililitro de agua ultrapura. Repita este paso de 5 a 10 veces hasta que la solución de enjuague salga transparente para eliminar las manchas no específicas. Después de aspirar el lavado final, agregue 1 mililitro de PBS frío e incube la placa a temperatura ambiente durante 10 minutos en una coctelera como antes. A continuación, transfiera el disco de fosfato beta-tricálcico teñido a un nuevo pozo y escanee las placas con un escáner plano para registrar la mineralización.