Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Biological Techniques
0 visualizaciones • 4:14 min. • July 8th, 2025
Los fibroblastos cardíacos activados por el estrés depositan un exceso de colágeno en las regiones lesionadas, una afección llamada fibrosis, que afecta la función cardíaca.
Para visualizar la extensión de la fibrosis, primero, seccione los bloqueos cardíacos incluidos en parafina. Coloque las secciones en una diapositiva. Calienta el portaobjetos para derretir la parafina, permitiendo que las secciones se adhieran.
Sumerja el portaobjetos en xilol para desparafinar el tejido. Trate las secciones con grados descendentes de alcohol, para rehidratar las secciones y ayudar a la unión posterior de los componentes acuosos de la tinción.
Incubar las secciones en un fijador ácido que entrecruza las proteínas, estabilizando la estructura del tejido. Enjuague con agua para eliminar el fijador residual.
Sumerja el portaobjetos en una solución de hematoxilina. El colorante catiónico se une al ADN cargado negativamente, tiñendo el núcleo de azul. Enjuague con agua para eliminar el exceso de manchas.
Incube el portaobjetos en ácido Fuchsin-Ponceau, un colorante aniónico de molécula pequeña que interactúa con proteínas citoplasmáticas y colágeno cargados positivamente, tiñéndolos de rojo. Tratar con ácido acético diluido, para eliminar el exceso de manchas.
Sumerja el portaobjetos en una solución de ácido fosfomolíbdico-naranja G. El naranja G, un colorante de molécula pequeña, tiñe los eritrocitos de rojo anaranjado. El ácido fosfomolíbdico, un ácido de molécula grande, expulsa los colorantes de moléculas pequeñas del colágeno, haciéndolo incoloro.
Incube las secciones en tinte verde claro, cuyas moléculas se unen a las fibras de colágeno, coloreándolas de verde. Bajo un microscopio, las regiones fibróticas aparecen en verde, lo que indica una deposición excesiva de colágeno.
En este procedimiento, prepare secciones de tejido de cinco micras de espesor de los bloques de parafina con un micrótomo manual. A continuación, tiña un portaobjetos de cada sección del corazón, para cada rata con tinción tricrómica de Masson-Goldner. Para las secciones de parafina, derrita los tejidos a 60 grados centígrados en un horno. Bajo una campana extractora, desparafíquelos en xilol dos veces, durante 10 minutos cada uno.
Luego, rehidrátelos en etanol 100%, etanol 95%, etanol 70% y luego agua destilada durante tres minutos cada uno. Para las secciones desparafinadas y para las criosecciones, fíjelas en una solución de Bouin durante la noche. A la mañana siguiente, enjuáguelos con agua corriente del grifo durante 10 a 15 minutos. Luego, enjuague nuevamente con agua destilada.
La fijación en Bouin es el paso más importante para garantizar una espléndida tinción de Goldner.
Incubarlos en hematoxilina de Mayer durante tres minutos. Después de 3 minutos, retire los portaobjetos y déjelos en agua destilada durante cinco minutos. Posteriormente, incubarlos en Fucsina ácida de Ponceau durante cinco minutos, antes de enjuagar con ácido acético al 1% durante un minuto.
A continuación, incube las secciones en ácido fosfomolíbdico Orange G durante un minuto y luego enjuáguelas en ácido acético al 1% durante un minuto. Incubar en tinte verde claro durante 10 minutos y luego enjuagar con ácido acético al 1% durante un minuto. Finalmente, deshidrate las secciones en etanol al 70% durante 30 segundos, etanol al 95% durante 30 segundos y etanol al 100% durante cinco minutos secuencialmente. Aplique una gota de medio de montaje resinoso sobre las secciones de tejido, cúbralas con cubreobjetos y colóquelas para que se sequen.