Cromatografía líquida de interacción hidrofílica: una técnica para separar analitos polares hidrófilos utilizando perlas hidrofílicas

La cromatografía líquida de interacción hidrofílica, HILIC, es una técnica para separar compuestos polares hidrófilos en función de su grado de polaridad. Comience configurando una columna HILIC llena de perlas hidrofílicas que transportan grupos funcionales polares.

Primero, acondicione la columna usando un tampón de equilibrio y una fase móvil, una mezcla de solvente orgánico y agua. Las moléculas tampón estabilizan el pH, mientras que el disolvente orgánico satura la columna. Las moléculas de agua se inmovilizan y crean una capa acuosa sobre las perlas hidrofílicas.

Cargue la muestra que contiene una mezcla de glicanos (compuestos polares hidrófilos) marcados con una etiqueta fluorescente. Pase la muestra utilizando un gradiente de fase móvil a través de la columna a un caudal óptimo.

A medida que la muestra se mueve a lo largo de la fase móvil hidrofóbica, los glicanos migran a la capa acuosa, dejando atrás las impurezas. Posteriormente, los glicanos se mueven hacia los grupos funcionales polares en las perlas. Aquí, los glicanos más polares se unen fuertemente, mientras que los menos polares se unen sin apretar.

A medida que disminuye la hidrofobicidad de la fase móvil, los glicanos débilmente unidos con menos polaridad y un tiempo de retención más corto eluyen primero. Por el contrario, los glicanos fuertemente unidos con mayor polaridad y un tiempo de retención más largo eluyen al final.

Finalmente, un detector detecta la señal fluorescente de las fracciones eluidas, correspondientes a los picos de glicanos estándar en el cromatograma.

Primero, abra el software para controlar las fases móviles. Lave los instrumentos UPLC con 50% de disolvente B y 50% de disolvente C a un caudal de 0,2 mililitros por minuto, durante 30 minutos. Luego lave, con un 25% de solvente A y un 75% de solvente B a un caudal de 0,2 mililitros por minuto, durante 20 minutos, luego, a un caudal de 0,4 mililitros por minuto.

Disuelva los N-glicanos marcados con 25 microlitros de una mezcla de acetonitrilo 100% y agua ultrapura en una proporción de 2:1 (volumen/volumen). Luego, centrifugue a 134 x g durante 5 minutos a 4 grados Celsius y use un tubo de impulsión para cargar 10 microlitros del sobrenadante en los instrumentos UPLC.

Separe los N-glicanos marcados a un caudal de 0,4 mililitros por minuto, con un gradiente lineal de 75% a 62% acetonitrilo durante 25 minutos. A continuación, realice una ejecución analítica con la escalera de calibración de dextrano/columna de glicopéptido en un UPLC a 60 grados Celsius.

Detecte la fluorescencia de N-glicano en longitudes de onda de excitación y emisión de 330 nanómetros y 420 nanómetros respectivamente.