Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Neuroscience
0 visualizaciones • 3:30 min. • July 8th, 2025
Tome un ojo de ratón intacto en líquido cefalorraquídeo artificial, o aCSF, e incida para aislar el ocular que contiene la retina.
Tratar con una solución enzimática para eliminar la membrana limitante interna, exponiendo las células neuronales.
Sumerja el tejido en una solución de inhibición para detener la digestión y lávelo para eliminar el exceso de solución.
Coloque el tejido en una incubadora especializada a baja temperatura para ralentizar el metabolismo celular, preservando el tejido.
Esta incubadora consta de una cámara principal con una malla para el montaje de tejidos. La cámara se llena con aCSF, y su temperatura y pH se controlan para preservar la funcionalidad del tejido.
Para eliminar la contaminación microbiana, el aCSF se bombea a otra cámara y se trata con radiación ultravioleta para matar cualquier microbio.
Luego, el aCSF esterilizado se bombea nuevamente a la cámara principal.
Para aislar la retina, retire el ocular, separe la retina del tejido circundante y devuélvala a la incubadora.
Para la preparación de la montura completa de la retina, enuclee inmediatamente los ojos de un animal sacrificado. Haga un pequeño corte a lo largo de la ora serrata y coloque los ojos en Ames Media o aCSF con suministro de carbohidratos a temperatura ambiente. Después de eso, retire inmediatamente la córnea, el cristalino y el vítreo cortando a lo largo de la ora serrata con unas tijeras pequeñas y retírelos con fórceps. Coloque el tejido en el sistema de incubación a temperatura ambiente.
Para eliminar la membrana limitante interna, transfiera el ocular que contiene la retina a un pequeño frasco de vidrio que contenga papaína, L-cisteína, EDTA y ADNasa a 37 grados Celsius durante 20 minutos. Aplique carbogen a la solución a través de la tapa, pero no burbujee. Detenga la digestión enzimática colocando el tejido en una solución de ovomucoide y BSA durante 10 minutos en el BSS de Earl. Luego, lave bien el pañuelo con aCSF.
Posteriormente, transfiera el tejido al sistema de incubación y reduzca la temperatura a unos 15 a 16 grados centígrados. Después de eso, transfiera el tejido de la retina al microscopio; Aísle la retina de la copa ocular y córtela en cuatro pedazos con una cuchilla de afeitar. Si se requiere toda la retina, haga cuatro pequeños cortes en la periferia de la retina para permitir que quede plana.
Este tejido ahora se puede transferir al microscopio para electrofisiología o mantenerse en la Braincubator. El tejido se mantiene en la cámara principal que contiene las sondas para medir el pH y la temperatura. Una segunda cámara se aísla de la cámara principal y se expone a luz UVC de 1,1 vatios para irradiar las bacterias que flotan en la solución. Use una bomba peristáltica para hacer circular un CSF a través de las dos cámaras y una placa fría termoeléctrica Peltier para enfriar o calentar la cámara principal.