Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Neuroscience
0 visualizaciones • 3:42 min. • July 8th, 2025
Tome fragmentos de hipocampos de ratón adultos perfundidos en un tubo de disociación que contenga papaína y ADNasa.
Coloque el tubo en un disociador mecánico.
El disociador desintegra mecánicamente el tejido, aflojando las células, incluidas las neuronas y las células gliales.
La papaína descompone la matriz extracelular del tejido, liberando células. La ADNasa degrada el ADN contaminante.
Agregue tampón que contenga BSA, inactivando las enzimas.
Pase la suspensión a través de un colador para eliminar los desechos grandes.
Centrifugar el filtrado. Deseche el sobrenadante rico en enzimas.
Vuelva a suspender las células en tampón y transfiéralas a un tubo nuevo.
Agregue medios de gradiente de densidad, mezcle y superponga la mezcla con tampón.
Durante la centrifugación, las células y los desechos forman capas separadas según sus densidades.
Retire la capa de amortiguación superior y la capa de escombros del medio.
Agregue tampón a la capa inferior que contiene las celdas y mezcle. Centrifugar y desechar el sobrenadante que contiene el medio de gradiente de densidad.
Vuelva a suspender las células del hipocampo en el tampón para su posterior análisis.
Con fórceps, transfiera las piezas de tejido del hipocampo a un tubo C y agregue 30 microlitros de mezcla de enzimas 2 en el tubo. Después de girar la tapa y apretarla hasta que haga clic, coloque el tubo en un disociador y ejecute el programa apropiado. Mientras se ejecuta el programa, humedezca previamente un filtro celular de 70 micras colocado en un tubo cónico de 50 mililitros con 2 mililitros de tampón BSA.
Una vez completado el programa de disociación, agregue 4 mililitros de tampón BSA al tejido disociado y filtre la mezcla a través del filtro celular en el tubo cónico de 50 mililitros. A continuación, agregue 10 mililitros de DPBS al tubo en C. Luego cierre el tubo, agite la solución suavemente y fíltrela a través del filtro celular en el tubo cónico de 50 mililitros. Centrifugar la suspensión celular filtrada. Deseche el sobrenadante sin alterar el pellet y guárdelo.
Para la eliminación de escombros, vuelva a suspender el gránulo con 1,550 microlitros de DPBS frío y transfiera la suspensión a un tubo cónico etiquetado de 15 mililitros. Luego, agregue 450 microlitros de solución de eliminación de escombros fríos y pipetee hacia arriba y hacia abajo. Cubra suavemente la suspensión celular con 1 mililitro de DPBS frío, manteniendo la punta contra la pared del tubo cónico. Repita el procedimiento hasta que la superposición total sea de 2 mililitros.
A continuación, centrifuga la suspensión a 3.000 veces g durante 10 minutos con aceleración y freno a fondo. Aspira la capa superior. A continuación, mueva la punta de la pipeta hacia adelante y hacia atrás para aspirar la capa intermedia blanca. Retire la mayor cantidad posible de la capa intermedia sin alterar la capa inferior. A continuación, agregue 2 mililitros de DPBS frío y pipetee hacia arriba y hacia abajo para mezclar. Luego, centrifuga la suspensión a 1.000 veces g durante 10 minutos con aceleración completa y freno completo. Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el sedimento en un tampón BSA de 1 mililitro.